202558. lajstromszámú szabadalom • Eljárás neuronotrófiás faktor kinyerésére és ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmény előállítására
HU 202558B 7 8 1. táblázat A SZARVASMARHA AGYVELŐBEN LEVŐ NEURONOTRÓFIÁS FAKTORFŐ TISZTÍTÁSI LÉPÉSEINEK ÖSSZEFOGLALÁSA Tisztítási stádium Összes fehérje mg Tiszt. faktor Fajlagos aktivitás pg/TU* Összes TU* TU* Kinyerés % Homogenizátum Felülúszó a savas kicsapás 11625 1-után 750 15,5 6 125000 100 Sephadex G-150 14,7 791 0,3 49000 39 CM-HPLC 0,361 32202 0,01 36100 29 <1 *TU - trófiás egység: definíciószerűen az a fehérje-koncentráció pg/cm -ben, amely fele annyi neuron túlélését biztosítja, mint azoknak a neuronoknak a maximális száma, amelyek túlélnek az aktív anyag telítési koncentrációjának hatására. A „neuronok túlélése” az az idő, amely alatt a mesterséges kultúrába vitt neuronok életképességüket a kultúrában megtartják. A teljes homogenizátum savas kicsapása, semle- 20 gesítése és dialízise után kapott, nyers, felülúszó frakció biológiai aktivitása tripszin-érzékeny, ami azt mutatja, hogy az aktív molekula fehérje vagy peptid természetű. Az említett, nyers, felülúszó kivonatban jelen levő, biológiailag aktív molekula a 25 Sephadex G-150 oszlopról olyan frakciókban eluálódik, amelyeknek a móltőmege 10 000 és 30 000 dalton között mozog (1. ábra). Az 1. ábra görbéi a szarvasmarha caudatus teljes homogenizátumából kicsapás, semlegesítés és dialí- 30 zis után kapott felülúszó Sephadex G-150 oszlopon nyert tipikus elúciós profilját mutatják, a folyamatosan regisztrált optikai sűrűséget a kilodaltonban kifejezett molekulatömeggel szembeállítva. A három görbe ugyanazon minta három különböző érzé- 35 kenységű mérés eredménye. Mindegyik frakció biológiai aktivitását megvizsgáltuk, miközben a fehérje-koncentráció 0,01 és 10 pg/cm3 között változott. Aktivitást az 1. ábrán vízszintes vonallal jelzett frakciókban kaptunk. 40 A Sephadex G-150 oszlopról eluált, aktív frakciókban levő, biológiailag aktív molekula a TSK-CM- 3SW oszlopról 1 mól/1 körüli ammónium-acetát puffer koncentrációnál eluálódik (2. ábra). A 2. ábra a Sephadex G-150 oszlopról eluált, ak- 45 tív frakciók TSK-CM-3SW oszlopról nagynyomású folyadékkromatográfiával kapott, tipikus elúciós profüját mutatja. A tisztítás a leírt körülmények között történt. Mindegyik frakció biológiai aktivitását megvizsgáltuk, miközben a fehérje-koncent- 50 rációk 0,001 és 0,3 pg/cm3 között változott. A vízszintes vonal által mutatott aktivitást az 1 mól/1 körüli ammónium-acetát koncentrációknál eluálódó frakciókban kaptuk. Ez utóbbi elúciós idő hasonló a cytochrome C re- 55 tenciójához, ami azt mutatja, hogy az aktív molekula izoelektromos pontja is hasonló a cytochrome tjéhez, vagyis mintegy 10-10,5. Ez a tulajdonság megkülönbözteti a jelen aktív molekulát a CNTF- től, amelynek izoelektromos pontja mintegy 5. 60 Az SDS-PAGE (poliakrüamid) gélelektroforézishez V. Lee és mts. módszere szerint (Neuroscience, 6, 2773 /1981/) 12,5 tömeg/térfogat%-os poli(akril-amid) géltömböt használtunk és nemfolytonos puffert, amely U.K Laemmli módszere szerint 65 (Nature, 227,680/1970/) SDS-t tartalmaz. A tisztítási eljárás fő lépéseiből (a teljes homogenizátum savas kicsapása utáni felülúszó kivonatának semlegesítése, dialízise és Sephadex G-150 és TSK-CM- 3SW oszlopon végzett tisztítása után) származó, biológiailag aktív anyagok elektroforézis képét a 3A. ábra mutatja. Az ábrán az ezüsttel megfestett SDSPAGE gélelektroforetogramm látható, ahol az 1. és 5. csíkban BioRad standard fehérjét, a többiben csíkonként 5 pg fehérjének megfelelő mennyiségű aktív anyagot futtattunk a tisztítási eljárás fő lépései után, vagyis a teljes homogenizátum savas kicsapása, semlegesítése és fagyasztva szárítása után (2. csík), a Sephadex G-150 oszlopon és a TSK-CM- 3SW oszlopon végzett eluálás után (3. és 4. csík). A standard móltömeg-jelző anyagok a kővetkezők voltak: miozin (móltömeg 200 000), béta-galaktozidáz (móltömeg 116 250), foszforiláz b (móltömeg 92 500), marha szérumalbumin (móltömeg 66 200), ovalbumin (móltömeg 45 000), szén anhidráz (móltőmeg 31 000), szójabab tripszin inhibitor (móltömeg 21500) és lizozim (mól tömeg 14 400). Az elektroforézishez használt minta-puff er a következőket tartalmazta: 62,5 mmól/1 trisz(tri/hidroxi-metü/-amino-metán) (pH 6,8), 10 tömeg/térfogat% glicerin, 2 tömeg/térfogat% SDS (nátrium-dodecil-szulfát), 2,5 mmól/1 EDTA, 2,5 mmól/1 EGTA, 0,01% brómfenolkék és 5% béta-merkapto-etanol. A TSK-CM-3SW oszlopról eluált, biológiailag aktív anyag egyetlen sávként vándorolt, móltömege hasonló a standardként használt (BioRad), 14 400 dalton móltömegű lizoziméhoz. Ez a móltömeg megkülönbözteti ezt az aktív molekulát a többi, már azonosított neurontrófiás faktoroktól (NGF, CNTF, BDNF). A TSK-CM-3SW oszlopról eluáló, aktív anyag SDS-PAGE gélelektroforetikus vándorlása nem hasonló az egerek állkapocs alatti mirigyéből nyert béta-NGF-éhez (3B. ábra). A 3B. ábra példát mutat be az ezüsttel megfestett SDS-PAGE elektroforetogrammra, standardként BioRad indikátorokat (1. és 4. csík), mintaként pedig egér állkapocs alatti mirigyéből nyert 2,5 pg béta-NGF-et (2. csík) és 2,5 pg TSK-CM-3SW oszlopról eluált aktív anyagot (3. csík) alkalmazva. A standard fehérje ugyanaz volt, mint a 3A. ábrán Az NGF a vándorlás során a TSK-CM-3SW osz-5
