202558. lajstromszámú szabadalom • Eljárás neuronotrófiás faktor kinyerésére és ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmény előállítására

HU 202558B

9

10

lopról eluálódó, aktív molekula mögött marad. Ismeretes, hogy a BDNF vándorlási helyzete az SDS elektroforézis során hasonló az NGF-éhez. Ez tehát azt is jelzi, hogy a TSK-CM-3SW oszlopról eluálódó, aktív molekula a BDNF-től is különbözik.

A tisztítási eljárás főbb lépései után nyert anyagok (a teljes homogenizátum savas kicsapása, semlegesítése és dialízise utáni nyers felülúszó kivonat; a G-150 oszlopról nyert eluátum; a TSK-CM-3SW oszlopról eluált anyag) biológiai aktivitását szokásosan úgy határoztuk meg, hogy megfigyeltük a hatását egérmagzatból kinyert, szérummentes tenyészeten tartott, disszociált, primer, középagyi sejtek túlélésére. Ezen túlmenően meghatároztuk a JH- dopamin fajlagos felvételét dopaminerg neuronokbán és a 14C-GABA fajlagos felvételét GABAerg neuronokbán, amelyek a tenyésztési rendszerben jelen vannak. így a morfolgóiai kritériumokat is hitelesítettük ill. megerősítettük.

Az alábbiakban ismertetjük a sejttenyészet előállításának módszereit, a sejtek túlélésének értékelését és a fajlagos anyagfelvétel paramétereit a sejttenyészet előállítási jellemzőinek fényében, valamint a tisztítási eljárás fő lépései után nyert anyagok hatásait.

1. A sejttenyészet előállítási módszere és a sejttípusok in vitro értékelésére használt immunkémiai kritériumok

13-napos egérembrió agyvelejéből sterü körülmények között kivágtuk a rosztrális középagyi tegmentumot. Az összegyűjtött agyrészeket PBS-ben mechanikusan szétoszlattuk. A PBS oldat millimoláris összetétele a következő volt: 136,8 NaCl; 2,7 KC1; 8 Na2HP04.7H20; 1,5 KH2PO4; glukóztartalma 6 mg/cm3, marha szérumalbumin tartalma 0,1 mg/cm,pH-ja 7,4 volt. A sejteket 45 min'1 fordulatszámon 4 percig centrifugáltuk, a tenyésztési közegbe visszaszuszpendáltuk, átbocsátottuk 20 pm-es Nytex-szűrőn, a sejteket Coulter számlálóval megszámláltuk, és 35 mm-es Falcon szövettenyésztő műanyagtálban szétterítettük.

Mindegyik tálat befedtük marhabőr-kollagénnel (Vitrogen, 100 pg fehérje), Eagle-féle tenyésztési alapközeget (BME), NaHC03-ot és NaOH-ot használva úgy, hogy az ionerősséget és a pH-t növeljük (T. Elsdale és mts.: J. Cell. Bioi., 54,626/1972/).

AtenyésztőközegBMEésHam-féleF12 1:1 arányú elegye volt, kiegészítve 33 mmól/1 glukózzal, 2 mmól/1 glutaminnal, 15 mmól/1 NaHC03-tal, 10 mmól/1 N-2-(hidroxi-etü)-piperazin-N’-2-etánszulfonsawal (HEPES), továbbá U. Di Porzio és pats. (Nature, 288,370/1980/) javaslatára 25 pg/cm3 inzulinnal, 100 pg/cm3 transzferrinnel, 60 mmól/1 putreszcinnel, 20 mmól/1 progeszteronnal, 30 mmól/1 nátrium-szelenittel, 0,5 egység/cm3 penicillin G-vel, 0,5 pg/cm3 sztreptomicinnel; tartalmazott még 30 mmól/13,3’,5’-trijód-DL-tironint (J. Puymirat és mts.: Neuroscience, 10, 801 /1983/). Általában 2 cm3, a kívánt disszociált sejtszámot tartalmazó tenyészközeget tettünk egy-egy tálba.

A sej t-típusok in vitro azonosítását közvetett immunfluoreszcenciás vizsgálattal végeztük, neurofilament fehérjék elleni, RT97 monoklonális antitest alkalmazásával (B.H. Anderton és mts.: Nature,

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

298,84 /1982/), amely a neuronsejtek specifikus in vitro indikátora (P. Doherty és mts.: J. Neurochem., 42, 1116 /1984/). Eszerint a tenyészeteket 7 percig -20 ’C-on metanollal rögzítettük, a rögzített tenyészeteket áteresztővé tettük 0,1 térfogat%-os Triton X-100 (poli/oxi-etüén/éter) kezeléssel PBS-ben 30 percig, majd tovább inkubáltuk 60 percig 10% fötális borjúszérumot tartalmazó PBS-ben a nemspecifikus fehérjekötő helyek blokkolása céljából. PBS- ben 1:500 hígítású, neurofilament elleni antitesttel inkubáltunk szobahőmérsékleten 60 percig, majd 10% fötális borjúszérumot (FCS) tartalmazó PBS- sel háromszor öblítettünk. A tenyészethez ezután rodaminnal konjugált, vagy affinitású, tisztított, antiegér kecske-IgG-t adtunk 1:100 hígításban, szobahőmérsékleten 60 percig. Ismét öblítettünk háromszor 10% FCS-t tartalmazó PBS-sel, végül glicerin és PBS 1:1 arányú elegyébel fedőlemezre vittük, és rodamin epifluoreszcenciás és fáziskontraszt optikával felszerelt Zeiss ül fénymikroszkóp alatt megvizsgáltuk. A közvetlen immunfluoreszcenciához egér gliális, fibriliáris, savas fehérje (GFAB) antiszérumát használtuk (az asztrocita sejtek specifikus in vitro jelzésére), majd nagy affinitású, tisztított, rodaminnal konjugált, antiegér kecske-IgG-t vittünk be M.C. Raff és mts. (Brain Res., 174, 283 /1979/) eljárásával.

2. A sejt-túlélés időbeli lefolyásának meghatározása a tenyészetben

A sejtek túlélését morfológiai kritériumok (vagyis a túlélő sejtek számának időbeli alakulását fáziskontraszt mikroszkóppal mérő, in vitro módszer), a DNS-tartalom biokémiai meghatározása és az egyes tálakban a túlélő dopaminerg sejtek számának időbeli alakulása alapján értékeltük. A DNS- tartalmat B.G. Erwin és mts. (Anal. Biochem., 110, 291 /1981/) módszere alapján határoztuk meg, az egyes tálakban található dopamering sejtek számát pedig úgy mértük, hogy a specifikus dopamin-felvétel után szemmel észleltük a fluoreszkáló neuronokat glioxilsawal kiváltott fluoreszcencia (GIF) módszerével G. Bolstad és mts. (Comp. Biochem. Physiol., 62,61119191) szerint. Az utóbbi esetben a sejteket katecholamin-epifluoreszcenciás és fáziskontraszt optikával felszerelt Zeiss ül fénymikroszkóppal figyeltük meg. Előre rögzített koordinátákkal a legalább a teljes terület 3%-án számoltukmeg a GIF-pozitív neuronokat.

3. A specifikus dopamin- és GABA-felvétel meghatározási módszere

A 3H-dopamin specifikus felvételének értékelését B. Berger és mts. (Neuroscience, 7, 193 /1982/) szerint végeztük. A sejteket egyszer mostuk előmelegített PBS-sel, amely 5 mmól/1 glukózt, 1 mmól/1 CaCl2ot, 1 mmól/1 MgS04-ot, 0,1 mmól/1 aszkorbinsavat, 0,1 mmól/1 pargilint tartalmazott, majd 5 percig előindukáltuka fenti oldat 0,8 cm3-ével. Szükség esetén az inkubáló oldathoz 5 mmól/1 benztropint, 5 mmól/1 dezmetüimpiramint ül. 1 mmól/1 fluoxtint is adtunk. Szokásosan 0,2 cm3 3H-dopamint hozzáadva (végső koncentráció: 50 mmól/1, fajlagos aktivitás: 22-33 Ci/mmól), az inkubálást 37 °C-on 15 percig folytattuk. Ekkor a dopamin-felvételt leállítot-6