202558. lajstromszámú szabadalom • Eljárás neuronotrófiás faktor kinyerésére és ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmény előállítására

HU 202558B

5

6

ra ható neuronotrófiás faktor (SDNF) előállítására, oly módon, hogy

1) emlős-, előnyösen szarvasmarha-agyvelő szövetet homogenizálunk,

2) a kapott homogenizátumot 4-5 pH értéken le- 5 választjuk,

3) a kapott szupematáns folyadékot dializáljuk egy 5 és 10 kilodalton molakulatömeg közötti viszszatartású dializáló membránnal,

4) a dializált szupematáns folyaédkot kromatog- 10 ráfiásan frakciónáljuk egy molekulaszűrőn egy hígított puff erezett eluenssel 10 nmól/1 és 30 nmól/1 közötti koncentrációnál,

a fenti l)-4) műveleti lépéseket 0 °C és 6 °C közötti hőmérsékleten lefolytatva; 15

és kívánt esetben a kapott neuronotóniásan aktív frakciókat kationcserélő kromatográfiával tisztítjuk.

Akár friss, akár fagyasztott (pl. -70 °C-on) emlős agyvelőt használhatunk. Az alább bemutatott tiszti- 20

tási eljárás mindegyik lépését legcélszerűbb 0 és 6 °C közötti hőmérsékleten végrehajtani.

Egy-egy adag előállítására a teljes agyvelőt vagy annak egy részét 6 és 7,4 közötti pH-ra beállított pufferoldat 2 vagy 4 térfogategységével homogeni- 25

záljuk, majd célszerűen sósavval 4 és 5 pH közé, előnyösen 4,5 pH-ra savanyítjuk, és néhány órán át keverjük. A kicsapódott anyagot centrifugálással (pl. 40 000 min"1 fordulatszámon 40 percig) szétválasztjuk, a felülúszót semlegesítjük, hígított puffe- 30 roldat ellen dializáljuk olyan membránon, amelynek áteresztési móltömeghatára 5 és 10 kilodalton közé esik, majd az anyagot fagyasztva szárítjuk. A molekulaszitás frakcionálást úgy végezzük, hogy az állófázison a frakcionálási tartomány 5 és 150 kilo- 35 dalton között legyen. Az eluáláshoz olyan pufferoldatot használunk, amelynek koncentrációja 10 mmól/1 és 30 mmól/1 között, pH-ja 6 és 7,4 között mozog. A biológiailag aktív frakciókat összegyűjtjük, fagyasztva szárítjuk, majd kationcserélő kro- 40 matográfiás oszlopra visszük fel, és 0,1 mmól/1 és 1 mmól/1 között változó koncentrációjú, 6 és 7 közötti pH-jú ammónium-acetát pufferoldattal gradiens-elúcióval futtatjuk. A neuronotrófiás aktivitású rész az 1 mól/1 koncentráció közelében eluálódik. 45

Az aktív frakciókat ismételten összegyűjtjük, és fagyasztva szárítjuk,

A fenti eljárás a tisztítás bármelyik stádiumában megszakítható, ha a biológiailag aktív anyag már kellőképpen tiszta. 50

A találmány előnyös kiviteli módjának szemléltetésére az alábbi példát adjuk meg, de a találmány nem korlátozódik erre az esetre:

Vágóhídról kikerülő, friss szarvasmarha agyvelőből jegelt állapotbn kimetszük a nucleus cauda- 55

tust. Egy-egy adag előállításához mintegy 150 g caudatus szövetre van szükség (25-30 agyvelőből).

Ezt 3 térfogategység foszfáttal pufferolt 1:10 arányban hígított (pH 7,4) sóoldattal (PBS), amely 0,3 gm/cnr fenü-metil-szulfonil-fluoridot (PMSF) 60

és 1 mmól/1 etilénglikol-bisz(béta-amino)-etil-éter- N,N,N’,N’-tetraecetsavat (EGTA) tartalmaz, Polytron készülékben, 6-os beállítás mellett 60 másodpercig homogenizáljuk. Ezután sósavval 4,5 pH- ra savanyítjuk, 2 órán át jégen tartjuk, majd 40 000 65

min" fordulatszámon 40 percig centrifugáljuk. A felülúszót összegyűjtjük, 7,4 pH-ra semlegesítjük, egy éjszakán át dializáljuk 1:10 arányban hígított PBS-sel (pH 7,4) 8 kilodalton áteresztési határral, végül fagyasztva szárítjuk, és aliquot részekre osztva -20 ‘C-on tároljuk. Közvetlenül használat előtt az elkülönített részeket az eredeti térfogathoz képest 1/10-nyi mennyiségű desztillált vízben újra szuszpendáljuk, és meghatározzuk a fehérje-tartalmát G.L. Peterson módszere szerint (Anal. Biochem., 83

rumalbumin oldattal előzetesen telített, 0,45 mikrométer lyukméretű Millex szűrőn átszűrjük, és a kívánt mennyiségű, szűrt felülúszó frakciót szérummentes középagyi sejttenyészetekhez adjuk a neuronotrófiás aktivitás vizsgálata céljából.

8 x 120 cm-es, Sephadex G-150-tel (finom frakció) töltött oszlopot használunk a felülúszó komponenseinek mól tömeg szerinti szétválasztására. A fagyasztva szárított felülúszó termékeket desztüált vízben újra szuszpendáljuk, és felöntjük az oszlopra (mintegy 750 mg fehérjét 6 cm3 eluáló pufferben). Az eluáló puffer (pH 7,30) összetétele millimolaritásban a következő: 13,68 NaCl; 0,27 KC1; 0,8 Na2HP04.7H20; 1,5 KH2PO4.

Az oszlopot 90 cm3/h áramlási sebességgel eluáljuk, perisztaltikus szivattyú alkalmazásával. Az eluátum optikai sűrűségét folyamatosan regisztráljuk 280 nm-nél mérő UV-spektroszkóppal. Automatikusan 15 cm3-es frakciókat gyűtjünk, amelyeket fagyasztva szárítás után neuronotrófiás aktivitásra vizsgálunk. A gélszűréses kromatografálást hidegszobában, 4 ’C hőmérsékleten végezzük.

A Sephadex G-150 oszlopról eluálódó, biológiailag aktív frakciókat összegyűjtjük és fagyasztva szárítjuk. A fagyasztva szárított anyag aliquot részeit 110 mnrO.l mól/1 ammónium-acetát oldatban (pH 6,45) újra szuszpendáljuk. A fehérjéket 10mm3-ben határozzuk meg. A megmaradt 100 mm-t (1,9 mg fehérje) TSK-CM-3SW ioncserélő oszlopon nagynyomású folyadékkromatográfiának vetjük alá, 0,1 mól/1 és 1 mól/1 közötti ammónium-acetát koncentrációval gradiens-elúciót hajtva végre, 6,45 pH-n, 0,5 cm3/min áramlási sebességgel. A-pufferoldat: 0,1 mól/1 ammónium-acetát 6,45 pH-n, B-pufferoldat: 1 mól/1 ammónium-acetát 6,45 pH-n. A gradiens-profil: 0-20 perc között 100% A-oldat (izokratikus), 20-40 perc között 0% A/100% B-ig lineárisan változik, 40-70 perc között 0%A/100% B (izokratikus), 70-75 perc között 100% A/0% B-ig lineárisan változik. A frakciókat fagyasztva szárítjuk, majd újra szuszpendáljuk 0,6 cm3 foszfát-puff erben (10 mmól/1 pH 5,7).

A fehérjéket 100 mm3-ben mérjük, és a maradék anyagot használjuk biológiai vizsgálatra és SDS poliamidgél-elektroforézis vizsgálatra.

A tisztítási eljárás fő lépéseit és az elérhető tisztasági fokozat példaképpen az 1. táblázat foglalja össze fehérjére és a neuronotrófiás aktivitás százalékos kinyerésére vonatkoztatva. A fehérje és a trófiás aktivitás kinyerésének mértéke különbözteti meg a jelen eljárást a CNTF és aBDNF tisztításának egyéb módszereitől.

4