202556. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antikoaguláns hatású peptidalkohol-származékok előállítására
HU 202556B szőlősav, malonsav, borostyánkősav, glutársav, fumársav, almasav, borkősav, citromsav, aszkorbinsav, maleinsav, hidroxi-maleinsav, benzoesav, hidroxi-benzoesav, fenil-ecetsav, fahéjsav, szalicilsav, 2-fenoxi-benzoesav és a szulf onsavak, például a metán-szulfonsav és a 2-hidroxi-etán-szulfonsav. A karboxi-terminális aminosav-maradék sói a bármely megfelelő szervetlen vagy szerves bázissal képezett nem-toxikus karbonsav-sókat jelentik. Ilyen sók jellegzetesen a következők: alkálifém-, például nátrium- és kálium-sók; alkáli-földfém-, péládul kalcium- és magnézium-sók; a IDA csoportba tartozó könnyűfémek, ideértve az alumíniumot is, sói; és a szerves primer, szekunder és tercier aminokkal - amilyen például a trietilamin, prokain, dibenzilamin, L-etén-amin, N,N’-dibenzil-etilén-diamin, dihidro-abietil-amin, N-(rövidszénláncú)-alkil-piperidin és bármely más megfelelő amin - alkotott sók. A találmány szerinti eljárás során 1) az alfa-amino-csoporton és kívánt esetben az oldalláncon védett, az A9 vagy As aminosavnak megfelelő aminosavat kondenzálunk egy gyanta hordozóhoz; 2) ezt követően a többi, az alfa-amino-csoporton és kívánt esetben az oldalláncon védett aminosavat a karboxi-terminális végtől az amino-terminális vég felé haladva, As-Ai sorrendben, és végül az X csoportot kondenzáljuk a növekvő peptidlánc aminoterminális végéhez, mimellett a peptidláncban jelenlevő amino-védőcsoportokat eltávolítjuk, és 3) a gyantához kötött pepiidet 2 mól egyenértéknyi, az Ai o-ol-nak megfelelő karboxi-terminális aminoalkohollal és 1 mól egyenértéknyi, diklórmetánban oldott ecetsavval kezeljük és egyidejűleg a karboxi-terminális peptidalkoholt kondenzáljuk a pepiidhez, majd adott esetben az oldallánc védőcsoprotjait lehasítjuk. A szilárd fázisú szekvenciális eljárás standard automatizált módszerek alkalmazásával hajtható végre, például automatizált peptid-szintetizátor felhasználásával. Ezen eljárás keretében a peptideket a gyantán építik fel, az utolsó előtti C-terminális védett aminosawal kezdve. Az alkalmazott hordozó gyanta bármely megfelelő gyanta lehet, amelyet a peptid-kémiában a polipeptidek szilárdfázisú előállítására alkalmaznak. Előnyösen alkalmazható a polisztirol, amely kb. 0,5 - kb. 3% divinil-benzolt tartalmaz, keresztkötések formájában, és klór-metüezett vagy hidroxi-metilezett annak érdekében, hogy kötődési helyeket (sites) biztosítson az eredetüeg felvitt alfa-amino-védett aminosawal való észter-képzéshez. A szekvencia kapcsolással való kialakítása után a Boc védőcsoportot vagy helyén hagyjuk vagy eltávolítjuk és acilezzük az N-terminális amino-csoportot. A védett fragmentumnak a gyantából való kiszorítása a megfelelő amino-alkohol felhaználásával hajtható végre. A hidroxi-metü-gyantára egy például Bodánszky et al. ír le (ChemJndTLondon/ 38 1957-1598, /1966/). Egy klór-metilezett gyanta a kereskedelemben beszerehető (Bio Rád Laboratories, Richmond, Kalifornia) és egy Uyen gyanta előállítását Stewart et al. írja le (Solid Phase Peptide Synthesis, Freeman and Co., San Francisco, 19691. Fejezet, p. 1.-6.). A 3 védett aminosav Gisin eljárásával - Helv.Chim Acta 56,1476 (1973) - köthető a gyantához. Számos gyantához kötött, védett aminosav hozzáférhető a kereskedelemben. Erre példaként megemlítjük, hogy ha a találmány szerint olyan polipeptidet kívánunk előállítani, amelyben a karboxi-terminális vég egy Thr maradék, egy terc.butü-oxi-karbonü-(Boc)csoporttal védett Thr, egybenzilezett, hidroxi-metilezett fenil-acetamido-metü-(PAM)-gyantához kötve, alkalmazható és ez a termék a kereskedelemben beszerezhető. Miután megtörtént az alfa-amino-védett aminosavnak a hordozó gyantához való kapcsolása, a védőcsoportot valamüyen megfelelő eljárással - pl. metUénkloridos trifluor-ecetsav oldat, trifluorecetsav vagy dioxános HC1 oldat alkalmazásával - eltávolítjuk. A védőcsoport eltávolítása 0 °C és szobahőmérséklet közötti hőmérsékleten hajtható végre. Alkalmazhatók azonban más, specifikus alfa-amino-védőcsoportok eltávolítására standard módon alkalmazott hasító reagensek és körülmények is. Az alfa-amino-védőcsoport eltávolítása után a többi amino-védett aminosavat a kívánt sorrendben szakaszosan kapcsoljuk. Egy másik megoldás szerint az „oldat módszerrel" (solution method) több aminosav összekapcsolható, mielőtt a gyantára felvitt aminosav-szekvenciához kapcsolnánk ezeket. A polipeptid szekvenciában bevitt egyes aminosavak esetében alkalmazott alfa-amino-védőcsoport bármilyen, a szakember által ismert védőcsoport lehet. A figyelembe vehető alfa-amino-védőcsoportok típusai között megkülönböztethetjük a következőket: (1) acü típusú védőcsoportok, mint formil-, trifluoracetü-, ftalü-, toluol-szulfonü-(tozil-), benzolszulfonü-, nitro-fenü-szulfenü-, tritil-szulfenil-, 0- nitro-fenoxi-acetü- és alfa-klór-butirü-csoport; (2) aromás uretán típusú védőcsoportok, mint benziloxi-karbonil- és helyettesített benziloxi-karbonü-, például p-klór-benzüoxi-karobnü-, pá-nitro-benziloxi-karbonil-, 1 -(p-bifenilil)-l -metil-etoxi-karbonil-, alfa,alfa-dimetü-3,5-dimetoxi-benziloxi-karbonil- és benzhidrüoxi-karbonil-csoport; (3) alifás uretán védőcsoportok, mint terc-butiloxi-karbonil-(Boc)-, diizopropü-metoxi-karbonü-, izopropiloxi-karbonil-, etoxi-karbonü- és alliloxikarbonü-csoport; (4) cikloaücil-uretán típusú védőcsoprotok, mint ciklopentUoxi-karbonU-, adamantiloxi-karbonU- és ciklohexiloxi-karbonü-csoport; (5) tiouretán típusú védőcsoportok, pl. fenü-tiokarbonü-csoport; (6) alldl-típusú védőcsoportok, pl. trifenil-metü(tritil)- és benzü-csoport; és (7) trialkü-szilán-csoportok, mint trimetü-szilán. Kitüntetett alfa-amim-védőcsoport a terc-butiloxi-karbonil-csoport. A megfelelő kapcsoló reagens kiválasztása a szakember tudásához tartozik. Jól alkalmazható kapcsolószerek például: (1) karbodiimidek (pl. N,N’-diciklohexil-karbodiimid és N-etü-N’-gamma-dimetilamino-propilkarbodiimid; (2) diánamidok (pl. azN,N-dibenzü-ciánamid); 4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
