202555. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kristályos humán proinzulin előállítására
HU 202555B A találmány tárgya eljárás kristályos humán porinzulin előállítására. A rekombináns DNS módszerek beköszöntése megadta a lehetőséget a legkülönfélébb peptidek és proteinek előállítására. Az egyik ilyen protein az emberi proinzulin. A humán proinzulin egyrészt a humán inzulin előállításának felhasználható köztiterméke, másrészt a cukorbaj kezelésében önmaga is gyógyszer. A rekombináns DNS technikával előállított emberi proinzulin termék rendszerint egy vizes oldat, amit fagyasztva szárítanak, és így egy nem-kristályos port kapnak. Több szempontból - így például a tárolhatóság, a készítményként való feldolgozás, az izolálási és tisztítási eljárások szempontjából - előnyös lenne, ha az emberi proinzulint kristályos alakban kapnák meg. A találmány tárgya eljárás kristályos állapotban levő humán proinzulin előállítására. A kristályos humán proinzulin a humán proinzulin-só és a kétértékű cinkion komplexe, ahol az említett só kationja lítium-, kalcium-, nátrium-, kálcium-, ammonium-, magnézium- vagy báriumion. A kristályos humán proinzulin előállításánál 1) vizes oldatot készítünk, mely ml-énként tartalmaz: 5-50 mg humán proinzulint; 0,1-5 mg fenolt vagy krezolt; 0,03-0,6 mmól vízoldható sót, melynek kationja lítium-, kalcium-, nátrium-, kálium-, ammonium-, magnézium- vagy báriumion; és 0,2-5 mmól ekvivalens kétértékű cinkkationt (Zn2+); 2) a vizes oldat kémhatását pH - 5,4-6,5 értékre állítjuk be; 3) az oldatot kristályosodni hagyjuk; 4) kinyerjük a kristályos humán proinzulint a vizes keverékből. A találmány szerinti kristályos humán proinzulin. A komplex rendszerint hexamer állapotban van, azaz hat humán proinzulinmolekula koordinációs kötésben kötődik két Zn + ionhoz. A kation egyvagy kétértékű, és az alábbiak bármelyike lehet: lítium-, kalcium-, nátrium-, kálium-, ammonium-, magnézium- vagy báriumion. Előnyös a kálium-, nátrium-, kálium-, ammonium- vagy magnéziumkation, ezek közt előnyben részesítjük a nátrium-, kálcium- vagy ammóniumkationt. Legelőnyösebb a kálcium- vagy nátriumkation. A kristályos humán proinzulin találmány szerinti előállításánál számos paraméter és körülmény betartása fontos: a fenolvegyület jelenléte és koncentrációja; a kation mennyisége és minősége; a cinkion jelenléte és mennyisége; a kémhatás. Az oldatban az emberi proinzulin koncentrációja általában 5-50 mg/ml. Előnyösebb ennek a tartománynak az alacsonyabb felében maradni. Növekvően előnyös koncentrációtartományok: 5- 25 mg/ml; 10-20 mg/ml, illetve 13-17 mg/ml. Optimális, ha az eljárást 15 mg/ml humán proinzulinkoncentráicónál végezzük. A fenolvegyületet 0,1-5 mg/ml koncentrációban adjuk a kristályosító keverékhez. Előnyös müliliterenként 1-3 mg fenolvegyületet használni. A kristályos humán proinzulin kationja bármelyik lehet az előzőekben felsorolt kationok közül. Bármilyen vízoldható alakjában adhatjuk a kristályosító keverékhez, előnyös azonban kloridot 1 használni. Ajánlott a hidrogén-karbonát sókat elkerülni, minthogy valami ok miatt a hidrogén-kar bonát-anion úgy látszik zavarja a humán proinzulin sójának kristályosodását. Akationt olyan mennyiségben adjuk a kristályosító keverékhez, hogy a kation: humán proinzulin mólaránya 10:1-1500:1 tartományban legyen. Természetesen kétértékű katinonokból (Ca+ ’Mg++, Ba++) kisebb mennyiséget használunk, mint az egyértékűekből (Na+, K+, Li+, NH+4). Kétértékű kationoknál a humán proinzulinhoz viszonyított fenti arány általában 50:1, egyértékűeknél 200:1. Amennyiben a proinzulin koncentrációja 13 mg/ml, vagy ennél alacsonyabb, a túl magas kationkoncentráció rendszerint késlelteti a kristályosodást. A találmány szerinti kristályosítási eljárásban oldható cinksót használunk. Ilyen oldható só például a cink-klorid, cink-acetát, cink-citrát stb. A szükséges sztöchiometriai arány: egy cinkatom három humán proinzulin molekulára. A találmány szerinti eljárásban kevesebb mennyiségű cinkiont is alkalmazhatunk, ekkor azonban, noha a kristályosodás megtörténik, a kitermelés arányosan alacsonyabb lesz. Általában ezért a cinksót sztöchiometriai arányban - azaz 1 Zn++/3 humán proinzulin molekula - használjuk, míg a maximális mólaránynál két Zn++ ion jut egy humán proinzulin molekulára. A kristályosítás optimálisan végezve, olyan cinkionkoncentrációt választunk, hogy 2 molekula humán proinzulinra jusson egy cinkion. A kívánt mennyiségű humán proinzulint, fenolvegyületet, kationt és cinkiont tartalmazó keveréket pH - 3,5 alatti vagy pH - 6,5 feletti kémhatásnál készítjük el. Az elkészített keverék kémhatást pH - 5,4-6,5 értékre állítjuk be. Előnyös a kémhatást pH - 5,8- 6,3, még előnyösebb pH - 6,0-6,1 értéken tartani. Ezután 0°-40 °C hőmérsékleten hagyjuk, hogy megtörténjen a kristályosodás. Mint az várható, előnyös a kristályosítást az alacsonyabb hőmérséklettartományban, 5-25 °C hőmérsékleten végezni. Siettethetjük a kristályosodást, ha a keveréket kezdetben 25 °C, majd 5 “C hőmérsékleten kevertetjük. Felismertük, hogy a kristályos anyag kinyerése nagyban fokozható, ha a kezdeti kristályosító keverékről leöntjük az anyalúgot, és a kristályokat az anyalúghoz hasonló összetételű mosófolyadékkal mossuk. A mosófolyadék körülbelül az anyalúgban levő koncentrációnak megfelelően tartalmaz fenolvegyületet, kívánt kationt és cinksót. Tovább növelhetjük a kitermelést, ha az anyalúghoz tízszeres vízmentes etanollal mosott kristályok híg szuszpenzióját adjuk. Ez az eljárás elősegíti a humán proinzulin kristályos alakban való kinyerését. A kristályos humán proinzulin általános és előnyös kiviteli módja a találmány szerint a következő: A humán proinzulint vízben oldjuk 15 mg/ml koncentrációban, pH - 6,5-7,0 kémhatás mellett. 0,3% fenolt vagy krezolt (3 mg/ml) adunk az oldathoz, majd ezt követően annyi kívánt kationt szolgál-2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
