202555. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kristályos humán proinzulin előállítására
HU 202555B tató sót adunk hozzá, hogy az egyértékű kationokat tartalmazó só (nátrium-klorid, kálium-klorid, lítium-klorid vagy ammónium-klorid) koncentrációja 0,35M, a kétértékű kationokat tartalmazóé (kálcium-klorid-2-víz, magnézium-klorid vagy bárium- 5 klorid) 0.077M legyen. Az oldat kémhatását pH - 6,5 értékre állítjuk be, majd 1,16 mM cink-kloridot (2%-os cink-klorid-oldatból 0,8 ml-t 100 ml oldathoz) adunk hozzá. Amennyiben szükséges az oldat kémhatását híg nátrium-hidroxid-oldattal vagy só- 10 savval pH - 6,0-6,1 értékre állítjuk be. A keveréket 24 órán át keverjük 25 “C hőmérsékleten, majd újabb 24 órán át 5 ‘C hőmérsékleten. A keletkezett kristályokat hagyjuk leülepedni, majd az anyalúgot leöntjük. A leöntött anyalúgot percenként 2500-as 15 fordulatszámmal 2-3 percen át centrifugáljuk, és az anyalúgot ismét leöntjük. A kristályokat felszuszpendáljuk 1-2 térfogatnyi mosófolyadékban, ismét centrifugálunk és az anyalúgot leöntjük. A kristályokat ismét szuszpendáljuk, 1-2 térfogatnyi 20 mosófolyadékban, és a szuszpenziót folytonos keverés mellett lassan hozzáöntjük 10-15 térfogatnyi vízmentes etanolhoz. A keverést 10-15 percen keresztül folytatjuk, majd hagyjuk a kristályokat leülepedni, és az alkoholt leöntjük. A visszamaradt 25 keveréket centrifugáljuk, ismét mossuk vízmentes etanollal, újra centrifugáljuk és az alkoholos mosót leöntjük. A nyert kristályokat csökkentett nyomáson szárítjuk 12-24 órán keresztül. Az elmondattak szemléltetésére az alábbiakban 30 egy példát adunk meg. A példa kizárólag szemléltető célzatú, és a találmány oltami körét nem korlátozza. Példa 20 g fagyasztva szárított, tisztított emberi proin- 35 3 zulint feloldunk 1000 ml tisztított vízben, és így egy 19,53 mg/ml koncentrációjú humán proinzulinoldatot kapunk. 2 ml olvadt fenolt adunk az oldathoz, majd 250 ml 0,2%-os fenollal hígítunk, és így az oldat proinzulinkoncentrációja 15,62 mg/ml. Az oldat kémhatása pH = 6,5. 20 millilitereket kivéve (312,5 mg humán proinzulin), az egyes kivétekhez az alábbi kloridsók valamelyikét adjuk az adott mennyiségekben: 77 mM kálcium-klorid (0,456 ml 50%-os CaCl2 oldat); 75 mM, 150 mM és 300 mM nátrium-klorid (87,2 mg, 175,2 mg, illetve 350,4 mg); 75 mM, 150 mM, illetve 300 mM kálium-klorid (112 mg, 224 mg, illetve 448 mg); 75 mM, 150 mM, illetve 300 mM ammónium-klorid (80 mg, 160 mg, illetve 320 mg). Mindegyikhez hozzáadunk 0,16 ml 2%-os cink-klorid oldatot (ZnCl2) (76 jxg Zn++/ml, vagy 1,16 mM), és a kémhatást 10%-os sósavval pH - 6,0-6,1 értékre állítjuk be. A keverékeket 24 órán át 25 °C, majd 24 órán át 5 °C hőmérsékleten keverjük, majd hagyjuk leülepedni. A kristályosító keverékből a 24. és 48. órában mintát veszünk, a mintákat leszűrjük és megvizsgáljuk a humán proinzulin tartalomra, hogy meghatározzuk a kristályosodás végbemenetelét. A tiszta felülúszót leöntjük, a proinzulin kristályok visszamaradt szuszpenzióját lassan 10-15 térfogatnyi hideg vízmentes etanolhoz öntjük gyors kevertetés mellett. 10-15 perces kevertetés után, rövid centrifugálással a kristályos anyagot összegyűjtjük, az alkoholt leöntjük, a kristályokat alkohollal ismét mossuk, centrifugálunk és az alkoholt leöntjük. A kristályokat csökkentett nyomáson szárítjuk és lemérjük. Az alábbi táblázatban összefoglaltuk az így kapott eredményeket. 4 Kristályos humán proinzulin kinyerése anyalúg, % humán proinzulin só koncentráció, M 24 órán át szobahőmérsékleten 24 órán át 5 °C-on száraz kristály mg kinyerés (%) CaCl2 0,077 5,9 2,2 278 89 NaCl 0,075 23,9 10,1 250 80 NaCl 0,150 9,6 5,2 277 89 NaCl 0,300 13,7 10,9 281 90 KC1 0,075 17,8 7,8 269 86 KC1 0,150 9,6 5,6 282 90 KC1 0,300 8,9 6,3 256 82 NH4CI 0,075 6,9 5,8 269 86 NH4CI 0,150 7,8 5,3 265 85 NH4CI 0,300 9,9 6,1 269 86 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás kristályos humán proinzulin előállítására, azzal jellemezve, hogy 1) vizes oldatot készítünk, mely ml-énként tartalmaz: 5-50 mg humán proinzulint; 0,1-5 mg fenolt 60 vagy krezolt; 0,03-0,6 mmól vízoldható sót, mely az alábbi kationok valamelyikét tartalmazza: lítium-, kalcium-, nátrium-, kálium-, ammonium-, magnézium- vagy báriumon; és 0,2-5 mmól cinkkationt (Zn2+); 65 2) a vizes oldat kémhatását pH = 5,4-6,5 értékre állítjuk be; 3) az oldatot kristályosodni hagyjuk és 4) a vizes elegyből elválasztjuk a kristályos humán proinzulint. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a humán proinzulint 5-25 mg/ml koncentrációban alkalmazzuk. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a humán proinzulint 13-17 mg/ml koncentrációban alkalmazzuk. 3
