202549. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a 3'-azido-3'-dezoxi-timidin jód-125 izotóppal jelzett monojód-tirozin-metilészter származékainak előállítására
HU 202549B gens, azAZT-re specifikus antitest előállításában is. A találmányt a továbbiakban konkrét kiviteli példákon szemléltetjük, melyekre a találmány oltalmi köre természetesen nem korlátozódik. 1. példa Az (la) képletű céltermék előállítása A/ lépés: A (Óla) képletű köztitermék előállítása 100 mg (374 mikromól) AZT-t és 100 mg (1 mmól) borostyánkősav-anhidridet 2 ml piridinben 20 °C-on 24 órát kevertetünk. Ezután a piridint vákuumhídon, 0,0013 bar nyomáson, cseppfolyós nitrogénnel hűtött szedő-lombikba szobahőmérsékleten ledesztilláljuk, a maradékot pedig egyenlő térfogatokra elosztva három darab 20x20x0,2 cm méretű, DC-Alufolien Kieselgel 60/F254 (Merck, NSZK) rétegre 18 cm hosszú sávban üvegkapillárissal felvisszük, és a rétegeket 95%-os etil-alkoholba helyezve 17-18 cm oldószer-magasságig futtatjuk. A légszáraz rétegeket ezután 254 nm hullámhosszúságú ultraibolya fénnyel megvilágítjuk, a foltokat bejelöljük, és a 0,70-0,75 Rf értékű sávok helyén (a kiindulási AZT Rf értéke ilyen körülmények között 0,80-0,90) a szilikagélt lekaparjuk, 20 ml etil-acetátban szuszpendáljuk, majd üvegszűrőn szűrjük. Ezután az oldószert vízsugárszivattyúval 0,02 bar nyomáson, Rotavapor típusú forgóbepárló készüléken (Büchi, Svájc) lepároljuk. A kapott tennék színtelen olaj, súlya 87 mg, a kitermelés 63,3%. B/ lépés: a (Ha) képletű köztitermék előállítása Az AJ lépés szerint kapott 35 mg (95,2 mikromól) AZT-5’-hemiszukcinátot, 35 mg (180,4 mikromól, 2 ekvivalens) TME-t és 28 mg (147,7 mikromól, 1,55 ekvivalens) EDCI-HCl-t (Serva, NSZK) 5 ml etil-acetátban 20 *C-on 20 órán át kevertetünk. A reakcióhoz szükséges TME-t a kereskedelemben kapható L-tirozin-metilészter-hidrokloridból (Fluka, NSZK) nyerjük úgy, hogy vizes oldatához számított mennyiségű 1 mólos nátrium-karbonát oldatot adunk, a kivált csapadékot szűrjük, és forró etü-acetátból kétszer átkristályosítjuk. A reakció lezajlása után az oldószert forgóbepárló készüléken az AJ lépés szerint lepároljuk, és három részre osztva 3 db 20x20x0,025 cm méretű, DC-Alufolien Kieselgel 60/F254 (Merck, NSZK) rétegen kromatografáljuk 9:1 térfogatarányú kloroform:metanol oldószerelegyben. A további feldolgozást az AJ lépés szerint végezzük, azzal az eltéréssel, hogy a terméket 20 ml 95%-os etil-alkohollal oldjuk le. A kívánt termék Rf-értéke 0,55-0,60, míg a (Ela) kiindulási anyagé0,35-0,38, az AZT-é pedig 0,50-0,55. A termék fehér kristályos anyag, súlya 25 mg, a kitermelés 48,3%. CJ lépés: az (la) képletű céltermék előállítása A B1/ lépés szerint kapott (Ha) képletű köztitermék 1,09 mg/ml koncentrációjú etanolos oldatából 20 mikrolitert (40 mmól) 1 ml-es talpas műanyag Eppendorf csőbe pipettázunk, hozzáadunk 100 mikroliter foszfát puffert (50 mM, pH 7,4) és kb. 0,5 mmól — 37 MBq (1 mCi) radioaktivitású, hordozómentes (kb. 74 IBa/mmól; 2000 Ci/mmól) fajlagos aktivitású — Na1Z5I oldatot (MTA Izotópkutató Intézet terméke). Az elegyet összerázzuk, és hozzá - pipettázunk 25 mikroliter 4,8 mg/ml koncentrációjú (425 nmól hatóanyagot tartalmazó) klóramin-T 5 reagens oldatot, összerázzuk, és pontosan 1 perc múlva hozzáadunk 50 mikroliter 7 mg/ml koncentrációjú nátrium-metabiszulfit oldatot. A reakcióelegyet ezután a B/ lépés szerint, 1 db 20x20x0,025 cm-es rétegen kromatografáljuk. A radioaktív termékek helyét Berthold LB 2001 típusú (NSZK gyártmány) radiokromatogram szkennerrel kimutatjuk, és a 0,60-0,65 Rf értékű folt közepéből kb. 3 mm széles csíkot kivágva, 2 ml 20%-os étű-alkohollal leoldjuk, és a további célokra ezt az etanolos törzsoldatot használjuk. A kapott termék radioaktivitása 9,18 MBq (248 mikrocurie), a radiokémiái kitermelés 24,8%. 2. példa Az (Ib) képletű céltermék előállítása AJ lépés: a (Hlb) képletű köztitermék előállítása 8,3 mg (31 mikromól) frissen készített 5’-oxo- AZT-t és 3,5 mg (19,7 mikromól; 1,27 ekvivalens) OCMHA-HCl-t (Serva, NSZK) 0,5 ml piridinben 40 °C-on 2 órát kevertetünk. Ezután az oldószert az I. példa AJ lépése szerint ledesztüláljuk, majd a maradékot egy rétegen az 1. példa B/ lépése szerint kromatografáljuk, azzal az eltéréssel, hogy a futtatást 4:1 térfogatarányú kloroform:metanol oldószerelegyben végezzük. A további feldolgozást az 1. példa B/ lépése szerint végezzük, azzal az eltéréssel, hogy a 0,70-0,80 RF értékű terméket (a kiindulási 5’-oxo- AZT Rf értéke ilyen körülmények között 0,10) 20 ml acetonnal oldjuk le a rétegről. A termék fehér kristályos anyag, súlya 4,9 mg, a kitermelés 49,3%. B/ lépés: a (üb) képletű köztitermék előállítása Az AJ lépésben előállított (Hlb) képletű köztitermékből 4,9 mg-ot (15,3 mikromól) 5 mg (25,8 mikromól; 1,69 ekvivalens TME-vel és 4 mg (21,1 mikromól; 1,38 ekvivalens) EDCI-HCl-lel reagáltatunk 1 ml etü-acetátban, 20 °C-on, 20 órán át. A további feldolgozást az 1. példa B/ lépése szerint végezzük, azzal az eltéréssel, hogy a kromatográfiához egy db vékonyréteg-lapot használunk, és a 0,60-0,65 Rf értékű foltot választjuk el. A termék fehér kristályos anyag, súlya 2,4 mg, a kitermelés 31,6%. CJ lépés: az (Ib) képletű céltermék előállítása Mindenben az 1. példa CJ lépése szerint járunk el, azzal az eltéréssel, hogy a (Hb) kiindulási anyag 0,993 mg/ml-es etü-alkoholos törzsoldatából indulunk ki, és a 0,65-0,70 Rf értékű radioaktivitása II, 69 MBq (316 mikrocurie), a radiokémiái kitermelés 31,6%. 3. példa Az (I) általános képletű céltermékek elválasztása nagynyomású folyadékkromatográfia alkalmazásával Az 1. vagy 2. példa CJ lépéseiben kapott jelzési reakcióelegyet acetonitrülel kétszeresére hígítjuk, és 4,6x100 mm méretű Aquapore Cartridge Column, Spheri-5, C-18 (Pierce Aurochemie, Hollandia) oszlopon kromatografáljuk víz:acetonitrű:metanol 6:3:1 térfogatarányú oldószereleggyel, izokratikusan, LKB 1051 típusú (LKB, Svédország) HPLC-pumpa alkalmazásával. Az áramlási sebesség 1 ml/perc, a nyomásesés kb. 100 bar. Az eluens rádioaktivitását folyamatosan detektáljuk olymódon, hogy az oszlop elvezető csövét ólommal ámyé-6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
