202415. lajstromszámú szabadalom • Eljárás átmenő pórusokkal rendelkező membrán szerkezetek előállítására és hatékony pórusméretének változtatására
9 HU 202415 B 10 fragmenseken, majd a hordozón keresztül, így vastagabb folyadékfilm nem képződik a sejtfalfragmensek tetején. A térhélósitó ilyen módon történő felvitelének az az előnye, hogy az igen vékony folyadékfilmben a sejtfalfragmenseket mozgató, végleges rögzítésüket zavaró örvénylés alig alakulhat ki. Tíz perces permetezés, illetve térhálósitás után a kapott ultraszűrőmembránt háromszor mossuk desztillált vizzel, majd az említett európai szabadalmi leírásban megadott módon mérjük a szétválasztás élességét és az időegység alatt átfolyó mennyiséget. Megállapítható, hogy a peptidoglikánból álló támasztó rétegnek nincs befolyása az ultraszűrömembrán szétválasztási tulajdonságaira. A példában leírt eljárás különösen előnyös kiviteli módja szerint kiindulási anyagként a Clostridium thermohydrosulfuricum L111-69 sz. törzsének ép sejtjeit alkalmazzuk. A sejteket 50 mmólos, 7,2 pH-jú TRIC-HCl-pufferben sejtprés (French Pressure Cell Press, gyártja: American Instruments Corp., Silver Springs, Maryland, USA) segítségével feltárjuk. A készülék úgy működik, hogy a sejt szuszpenziót először nagy nyomás alatt komprimálja; fúvókán átlépve a hirtelen nyomáscsökkenés miatt a sejtek megrepednek. A kapott sejtfragmenseket a fenti pufferral háromszor mosva a sejt belső anyagaitól megtisztítjuk, és a citoplazmaréteget TRITON X-100 desztillált vizzel készített 1%-os oldattal 37 °C-on 30 percen át dezintegráljuk. A sejtfalfragmenseket centrifugálással elválasztjuk a lipidektől és egyéb szennyeződésektől, majd a példa első változata szerint feldolgozzuk. Az alábbiakban a találmány szerinti eljárás egyes műveleteire néhány előnyös változatot, példát közlünk. A hordozó kiválasztása és előkészítése Nejlon mikroszűrőmembránok, amelyeknél a szabad amino- és/vagy karboxilcsoportok számát sósavval vagy N,N-dimetil-propán-diaminnal végzett hidrolitikus bontás útján növelték. Az ilyen nejlon mikroszűrőmembránokra példaként az alábbi típusokat nevezzük meg (gyártja: Pali cég, Cortland, N. Y., USA):- Pali Biodyne, szabad araino- és karboxilcsoportokat tartalmaz 1:1 arányban;- Pali Aminodyne, szabad aminocsoportokat tartalmaz;- Pali Carboxydyne, szabad karboxilcsoportokat tartalmaz. A sejtfalfragmensek felvitele a hordozó membránra A sejtfalfragmensek metanolos szusz- 5 penzióját 50 °C-on sima hordozóra, például üveglapra hengereljük. A metanol elpárolgása következtében a szuszpenzió besűrűsödik, míg végül legfeljebb 200 nm vastagságú, nedves réteg marad vissza a hordozón. A 10 bevont hordozót formaldehiddel telített légkörbe helyezzük, és ott mintegy 30 percen át inkubáljuk, amikor is a sejtfragmensek inter- és intramolekuláris térhálósodása következik be. 4 °C-os desztillált vizet óva- 15 tosan a hordozóra permetezve leemelhetjük a vékony, összefüggő filmet a hordozóról, majd párás légkörben stabil, nagy pórusú hordozóra, például mikroszűrőbe helyezzük. 20 A sejtfalfragmensek mechanikai rögzítése a hordozón vagy hordozóban A 3. példa szerint előállított ultraszű- 25 rőmembrán aktiv (azaz sejtfalfragmensekkel bevont) oldalára mintegy 45 °C-on desztillált vízzel készített, folyósított 2%-os agart öntünk 0,5-2 mm rétegvastagságig. 20 °C-ra lehűlve az agar gélréteggé dermed. Ez a gól- 30 réteg védőréteget képez az ultraszűrómembrán számára, adott esetben előszűrőként használhatjuk nagyobb szennyeződések viszszatartásához. A gélréteget például elhasználódása vagy a gélpórusok elszennyeződése 35 miatt bármikor lehúzhatjuk és felújíthatjuk. Egy másik variáció szerint intra- és intermoiekulásan térhálósított sejtfalfragmenseket alkrilamid, bisz(akrilamid), iniciátor és gyorsító keverékében szuszpendálunk, és az 40 elegyet réteg alakjában 20 °C-on gélesítjük és polimerizáljuk. Pórusos hordozó keletkezik, amelyben a sejtfalfragmensek be vannak ágyazva. A hordozó ultraszűrómembránként alkalmazható. 45 A sejtfalfragmensek protein- vagy proteintartalmú molekuláinak rögzítése a hordozóhoz 50 A hordozómembrán szabad aminocsoportjait glutár-dialdehiddel (5%-os, 0,1 mólos Na-borátpufferban) aktiváljuk. A szuszpendált sejtfragmenseket az ultraszűró-berendezés alacsony nyomású oldalán például vízsugár- 55 -szivattyúval létesített vákuum (5-6xl04 Pa) szívóhatása révén a hordozóra úsztatjuk, ahol az aktivált aminocsoportokon rögzülnek. A protein- vagy proteintartalmú molekulák intra- és (egymás közt) intermolekuláris tér- 60 hálósítását 0,1 mólos 8,7 pH-jú trietanol-aminnal készített 2%-os dimetil-szuberimidáttal végezzük. Egy másik variáció szerint a hordozó membrán szabad karboxilcsoportjait l-etil-3- 65 -(diraetil-amino-propil)-karbodiimiddel (EDC) 7
