202415. lajstromszámú szabadalom • Eljárás átmenő pórusokkal rendelkező membrán szerkezetek előállítására és hatékony pórusméretének változtatására
11 HU 202415 B 12 aktiváljuk. A felesleges reagenst eltávolítjuk, és a reakciót 0,01 mólos, 4,75 pH-jú Na-acetátpufferral megszakítjuk. A sejtfragmenseket desztillált vízzel mossuk, desztillált vízben szuszpendáljuk, a szuszpenzióhoz hexametilén-diamint és 0,1 mólos EDC-t adunk, és a sejtfragmenseket az ultraszűró-berendezés alacsony nyomású oldalán létesített 5.104 Pa vákuum segítségével a hordozó membránra úsztatjuk. A sejtfragmensek protein- és proteintartalmú molekulái hexametilén-diamin hidakon keresztül az aktivált karboxilc6oportokhoz kapcsolódnak, intra- és intermolekuláris kötéseket hozva létre. A hordozó membrán és a sejtfalfragmensek közötti kovalens kötés az ultraszűrömembrán stabilitását lényegesen növeli; az akár 7 m/mp rááramlási sebességgel dolgozó ún. cross-flow üzemmódban fellépő mechanikai hatások az ultraszűrés szempontjából fontos sejtfalfragmenseket nem tudják lekoptatni. Térhálósítás Folyékonyfázisú térhélósító reagens esetében ezt a reagenst a sejtfalfragmensek pórusain keresztül kell préselni, ami azzal a veszéllyel jár, hogy a keletkező áramlás a hordozón vagy hordozóban elhelyezett sejtfalfragmenseket elmozdítja, végleges rögzítésüket megnehezíti. Ennek elkerülése érdekében célszerű, ha a térhálósitást, illetve elótérhálósítást gáznemű térhélósító reagenssel végezzük. Ultraszűrő-berendezésbe 100 nm pórusméretű nejlon mikroszűrőmembránt helyezünk. A berendezés alacsony nyomású oldalén 5.104 Pa vákuumot létesítünk, és a sejtfalfragmenseket a hordozóra vagy hordozóba úsztatjuk. A berendezésben a hordozó membrán felett formaldehiddel töltött tartály helyezkedik el. Térhálósítás céljából az ultraszüró-berendezés nyomáskamróját a formaldehiddel együtt 80 °C-ra melegítjük. Az ezen a hőmérsékleten a monomer forma mellett oligomer formában is jelenlévő formaldehid elpárolog és érintkezik a hordozó membránon deponált sejtfalfragmensekkel, aminek következtében a sejtfragmensek protein- és proteintartalmú molekulái intra- és interraolekulárisan térhálósodnak és a hordozó membránhoz kötődnek, főleg a hosszabb lánccal rendelkező, nagyobb felületeket átfogni képes oligomer formáknak köszönhetően. A gáznemű térhélósitó reagens előnye, hogy a végleges rögzítést zavaró örvénylés nem alakulhat ki. Két óra elteltével a felesleges formaldehidet egy órán át vízzel kimossuk. Előnyös, ha a gáz- vagy gőznemű anyaggal végzett térhálósítás után folyékony halmazállapotú térhálósitóval járulékos térhálósitást végzünk. A folyékony térhálósitó reagenst előnyösen csepegtetéssel visszük fel az előtérhálósított sejtfalfragmensekre, 8 majd a membrán hátulján létesített vákuum segítségével a fragmensek pórusain, illetve a pórusos hordozón keresztül elszivatjuk. Az előtérhálósított sejtfalfragmensek mechanikailag nem károsodnak. A formaldehiddel végzett elötérhálósítés után alkalmazandó folyékony térhálósitó például előnyösen lehet dimetil-szuberimidát (a protein -NHz csoportjainak térhálósitása) vagy EDC (a protein -COOH csoportjainak térhálósitása). Az alábbi 4. példában vezikuláris membránokat tartalmazó szerkezetet írunk le, amelyet fel nem tárt mikroorganizmus-sejtek burkából állítunk elő. 4. példa: Vezikuláris membrán szerkezet előállítása A Bacillus stearothermophiles NRS 1536 sz. törzs ép sejtjeit (nedves súly: 10 g) TRITON X-10 050 mmólos 7,1 pH-jú TRIS-HC1- -pufferral készített 1%-os oldatában szuszpendáljuk és a szuszpenziót 37 °C-on 30 percen át keverjük. A koncentrációk kiegyenlítődése során a TRITON (kímélő nem-ionos detergens) az S-réteg pórusain és az alatta lévő, peptidoglikánból álló támasztó rétegen keresztül behatol a sejtbe, ahol a citoplazmamembránt dezintegrálja. Tekintve, hogy a citoplazmamembrán a sejtburok fő diffúzió-gátló sorompója, lebontása után a sejt belső anyagai kifelé diffundálhatnak. A detergens kezelés után a sejteket 20 000 g-vel centrifugáljuk, a megmaradt citoplazmamembránok lebontása céljából 60 °C-on további 10 percen át kezeljük a detergenssel, utána újból 20 000 g-vel centrifugáljuk. Az így kipreparált sejtburkokat négy mosási lépésben tisztítjuk (mindegyik lépés desztillált vízzel való elkeverésből, majd 20 000 g-vel folytatott centrifugálásból áll). A sejtanyag (riboszómák, nukleinsavak) maradványainak lebontása céljából a mosott sejtfalburkok szuszpenziójához 2 mg ribonukleáz és 2 mg dezoxiribonukleáz 40 ml desztillált vízzel készített oldatát adjuk, és az elegyet 30 °C-on 20 percen át keverjük. Utána a sejtfalakat 20 000 g-vel centrifugáljuk, majd desztillált vízzel többször mossuk. Az így kapott sejtburkokat 0,1 mólos, 8,5 pH-jú trietanol-aminban szuszpendáljuk, majd 10 ml szuszpenzióhoz 100 mg térhálósitó reagenst, például dimetil-szuberimidátot adunk. Hatvan perc reakcióidő eltelte után a térhálósított sejtfalburkokat 20 000 g-vel centrifugáljuk és desztillált vízzel mossuk. Az igy kikészített sejtburkokat a 2. példában ismertetett módon enzimproteinekkel tölthetjük. A találmány szerinti eljárás és a vele készített termékek néhány előnyös alkalmazási területét a fentiekben már említettük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
