202322. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiai minták 3'-azido-3'-dezoxi-timidin tartalmának radioimmunológiai meghatározására
3 HU 202 322 B 4 -125 izotóppal jelzett, nagy fajlagos aktivitású, (I) általános képletű AZT-származékokat használunk, amely képletben X jelentése a (II) vagy (ül) képlet szerinti csoport. A találmány szerint úgy járunk el, hogy hígítási sorozat szerint különböző, ismert mennyiségű inaktív AZT standard oldatokat, valamint az ismeretlen mintákat specifikus antitesttel inkubáljuk, majd az elegyhez 125I-AZT-TME tracert adunk, megfelelő inkubálási idő után az antitesthez kötött, illetve nem-kötött frakciókat elválasztjuk, és mérjük a kötött frakció radioaktivitását. A kapott radioaktivitás értékekből az ismeretlen minták által okozott kötésváltozásokhoz tartozó AZT-koncentrációkat kiszámítjuk. A radioimmun meghatározások előtt a különböző típusú mérendő biológiai mintákból a hatóanyagot megfelelő módszerrel kivonjuk, és a méréshez szükséges mértékig tisztítjuk. A találmány szerinti eljárásnak ugyanakkor jelentős előnye, hogy vérplazma vagy vérszérum esetében - amelyek várhatóan az eljárás elsődleges alkalmazási közegei lesznek - a hatóanyag elválasztására nincs szükség, a mintákat előkezelés nélkül, közvetlenül mérhetjük. Ezt a módszer nagy érzékenysége teszi lehetővé. Az AZT gyógyszerként való használata során a különböző szakirodalmi adatok [Lancet 1, 575 (1986), Clin. Pharmacol. Then 41, 407 (1987)] szerint várható adagolási mód (5 mg/testtömegkilogram) és hatásos vérkoncentráció (5 mikromól/1) mellett módszerünkhöz legfeljebb 1 mikroliter plazma vagy szérum szükséges. Nyúlban végzett modellkísérleteink alapján, a fenti dózisú AZT beadása után, a szemek a keringésből való igen gyors eltűnése ellenére a beadás után 20 órával az eljárás 1. példa szerinti kivitelezésével az AZT koncentráció 1 mikroliter vérplazmából még meghatározható, míg a terápiás koncentráció méréséhez 0,1 mikroliter plazma elegendő. Ezen kívül bizonyos határok között lehetséges a mérési tartománynak a megváltoztatása is, a mérendő koncentrációk szempontjából legkedvezőbb irányba. Ezt úgy érhetjük el, hogy a különböző tracereket különböző tulajdonságú antitestekkel kombináljuk. Az 1. ábra mutatja egymással egybevethető módon azokat a B/BO kötésfüggvényeket, amelyeket az (la), illetve (Ib) képletű tracerekkel kaptunk, különböző immunplazmák alkalmazásával. Szembetűnő, hogy azonos anliszérum esetén a tracerek kémiai szerkezete szerint, illetve azonos tracer esetén az immunplazma tulajdonságai szerint változik a mérési tartomány. Általában 10 000 és 60 000, előnyösen 20 000 és 40 000 cpm közötti beütésszámú tracert alkalmazunk, amelyet célszerűen pufferben oldunk. A puffer-oldat előnyösen 0,1% zselatint tartalmazó, 0,01^0,2 mólos, célszerűen 0,05 mólos, 7,4 pH-jú vizes foszfát puffer. Az oldat konkrét összetételétől függően az inkubációs hőmérséklet 0 és 40 °C közötti, előnyösen 0 *C körüli, az inkubálás ideje az adott hőmérséklettől függően 0,5 és 24 óra közötti, előnyösen 15-24 óra között változik. A módszerhez szükséges specifikus antitestet előnyösen nyúlban termeltetjük. Ehhez alkalmas AZT- származékokat, előnyösen pl. AZT-5’-hemiszukcinátot savamid kötésen keresztül alkalmas hordozó-fehérjéhez - előnyösen pl. szarvasmarha szérum albuminhoz - kötünk, és a nyulakat ezzel ismételten beoltjuk. Az immunizált nyulakból kapott anti-AZT antiplazma koncentrációját úgy választjuk meg, hogy az adott elválasztó reagens és inkubációs idő mellett az inaktív AZT-t nem tartalmazó mintában a tracer 10-80, előnyösen 30-60%-a kötődjön az antitesthez. A radioligand kötött és szabad frakcióinak elválasztására előnyösen 0,5% dextránt és 1% csontszenet tartalmazó 0,01 mólos foszfát puffer-oldatot (pH 7,4) alkalmazunk, amely a szabad radioligandumot megköti, és a centrifugálással kapott felülúszó tartalmazza az antitesthez kötött tracert, amelynek radioaktivitását szcintillációs módszerrel mérjük. A találmány szerinti eljárás előnyeit a következőkben foglaljuk össze: Az eljárás az AZT tartalom meghatározására radioimmun módszert alkalmaz, amelynek előnye az egyéb módszerekkel szemben, hogy kimagaslóan érzékeny és specifikus, ugyanakkor egyszerű, gyors és olcsó. Az eljárás szerinti radioimmun meghatározás jód-125-tel jelzett AZT-származékokon mint nyomjelző anyagokon alapul. A jód-125 izotóp alkalmazása biztosítja a radioimmunoassay módszerrel elérhető legmagasabb érzékenységet, ugyanakkor az izotóp méréstechnikája egyszerűbb, gyorsabb és olcsóbb a tríciuménál. Az eljárás heterológ radioimmunoassay-n és különböző kémiai szerkezetű tracereken alapul, és e tracerek AZT-től eltérő immunológiai tulajdonságainak kiaknázása lehetővé teszi a mérési tartomány célirányos szabályozását, amely módot ad a majdani klinikai mérésekhez megkívánt érzékenység beállítására. Az eljárás kimagasló érzékenysége mellett egyrészt szükségtelen a hatóanyagnak a mérendő biológiai közegből való kivonása, másrészt a mintában lévő zavaró komponensek hatása jelentősen csökken, azaz a meghatározás kiemelkedően specifikussá válik. A találmányt a továbbiakban konkrét példák alapján magyarázzuk, amelyre a találmány oltalmi köre természetesen nem korlátozódik. 1. példa Vérplazma AZT koncentrációjának meghatározása nyúl vénás véréből 10 ng/ml koncentrációjú standard AZT törzsoldatból pufferes hígítást készítünk úgy, hogy 1-1 ml térfogatú mintákat kapjunk, amelyek hatóanyag-koncentrációja 13,7-41-123-370-1110-3330 pg/ml. A standard oldatokból és a meghatározandó minták százszorosra, vagy ezerszeresre hígított pufferes oldataiból 100-100 mikrolitert sorszámozott műanyag kémcsövekbe automata pipettával hemérünk, majd hozzáadunk 100 mikroliter antiszérumot olyan hígításban, amely a tracemek 30- 40%-át képes megkötni. Ezután valamennyi csőbe bepipettázunk 100 mikroliter (la) képletű tracert, amelynek radioaktivitása 30 000-40 000 cpm/100 mikroliter. A nem-specifikus kötődés (NSB) meghatározására további kémcsövekbe az antiszérum helyett 100 mikroliter tiszta puffer-oldatot teszünk, míg a specifikus kötés (B/T) meghatározására a standard oldatok helyett is tiszta puffer-oldatot adunk az antitesthez. A teljes radioaktivitás (TC) meghatározása ugyanilyen összetételű csövekből történik. Minden egyes mérési ponthoz három párhuzamost (három azonos reagensösszetételű kémcsövet) használunk, és valamennyi kémcsőben a reakcióelegy térfogatát a szükséges térfogatú puffer hozzáadásával 400 mikroliterre egészítjük ki. Vala5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
