202322. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiai minták 3'-azido-3'-dezoxi-timidin tartalmának radioimmunológiai meghatározására
1 HU 202 322 B 2 A találmány tárgya eljárás biológiai minták 3’-azido-3’-dezoxi-timidin (továbbiakban AZT)-tartalmának radioimmunológiai meghatározására, melynek során megmérjük jód-125-izotóppal jelzett nagy fajlagos aktivitású AZT-származék mint nyomjelző anyag (továbbiakban radioligandum vagy tracer) specifikus antitesthez való kötődését ismert mennyiségű, különböző koncentrációjú standard oldatok és a meghatározandó minták jelenlétében, majd a standardokhoz tartozó kötésváltozások ismeretében a mintákhoz tartozó kötésváltozásokból kiszámítjuk azok hatóanyagtartalmát A találmány szerint ebben az immunkémiai reakcióban tracerként új típusú, (I) általános képletű - ahol X jelentése a (II) vagy (III) képlet szerinti csoport -, jód-125-izotóppal jelzett, nagy fajlagos aktivitású AZT származékokat alkalmazunk. Ismert, hogy az utóbbi évek legsúlyosabb fertőző betegsége, a szerzett immunhiányos tünetegyüttes (acquaired immun deficiency syndrome, közhasználatú rövidítéssel AIDS) lehetséges gyógyszereként a Bomoughs Wellcome által kifejlesztett szintetikus nukleozidanalóg, az AZT (egyéb védjegyzett neveken Zidovudine, Retrovir, BW A509U) humán preklinikai vizsgálatát a korábbi kedvező kísérleti eredmények alapján [Proc. Nat Acad. Sei. USA 82, 7096 (1985), Lancet 1, 575 (1986), Am. J. Med. 85 (Suppl. 2A), 189 (1988)] 1987 márciusában az Egyesült Államokban a Food and Drug Administration engedélyezte. Várható tehát, hogy az AZT hamarosan gyógyszerként bevezetésre kerül. Az eddigi kísérleti adatok szerint az AZT gyorsan eliminálódik a vérkeringésből, ugyanakkor a hatás elérése érdekében a hatóanyag vérkoncentrációját szűk határok között kell tartani. Ehhez olyan mérési módszer szükséges, amellyel az AZT koncentrációja gyorsan, olcsón, kellő érzékenységgel és pontossággal meghatározható. Erre a célra legalkalmasabb az antigén - antitest kötésen alapuló radioimmunoassay (RIA) eljárás. A módszerhez a mérendő molekula kellően magas fajlagos aktivitású, radioizotóppal jelzett formája szükséges. Ilyen célból dolgozta ki egy amerikai munkacsoport a közelmúltban a tríciummal jelzett AZT szintézisét [J. Labelled Comp. Radiopharm. 25, 277 (1988)]. Az ezen alapuló RIA eljárás nyomtatásban még nem jelent meg, de a közlemény már elfogadásra került. A közleménynek a szerzők által rendelkezésünkre bocsátott kéziratából megállapítható, hogy a tríciummal jelzett AZT alkalmas az AZT koncentráció radioimmun meghatározására. Szerzők a tríciumos traceren alapuló RIA eljárásukat összehasonlították az AZT meghatározására korábban alkalmazott [J. Chrom. 431, 123 (1988)] nagynyomású folyadék-kromatográfiás eljárással is, és megállapították, hogy a RIA módszer minden tekintetben előnyösebb. A tríciummal jelzett tracer alkalmazásának azonban hátránya, hogy az elérhető fajlagos aktivitás meglehetősen alacsony (a fent hivatkozott szakirodalmi forrás szerint az AZT-re kapott maximális fajlagos aktivitás 14 Ci/mmól), és ennek növelése csak bonyolult, többlépéses totálszintézissel képzelhető el, melyeknél külön hátrány, hogy az egyes szintézis-folyamatokat radioaktív anyagokkal kell végezni. Továbbá hátránya a tríciummal jelzett tracer alkalmazásának, hogy a trícium mérése költséges és munkaigényes. A találmány célja olyan RIA eljárás kidolgozása, mellyel biológiai minták AZT-tartalma egyszerűen, pontosan és érzékenyen meghatározható. A találmány szerinti eljárás az ismert - bár nyilvános közlésre még nem került - eljárástól abban különbözik, hogy tríciummal jelzett AZT helyett új típusú, jód-125 izotóppal jelzett, nagy fajlagos aktivitású AZT származékokat alkalmaz radioligandumként. A találmány alapja az a felismerés, hogy az AZT szöveti koncentrációjának meghatározása antigén - antitest kötésen alapuló radioimmun módszerrel úgy is lehetséges, ha az immunkémiai reakcióban (I) általános képletű, jód-125 izotóppal jelzett, nagy fajlagos aktivitású, új típusú AZT származékokat alkalmazunk. Ez a felismerés nem magától értetődő, mivel az így kapott származékok kémiailag különböznek az AZT-től, és így nem szükségszerű, hogy ezeket a specifikus antitest antigénként felismeri. Felismerésünk szerint az eljárást igen kedvezővé teszi, hogy a jód-125 izotóp méréstechnikája gyors, egyszerű és olcsó. További felismerés, hogy a mérési tartomány az (la) és (Ib) szerkezetű tracerek és adott, különböző immunspecificitású specifikus antitestek alkalmas megválasztásával tág határok közölt változtatható. Tapasztalati tény, hogy a Rí A-ban alkalmazott radioligand fajlagos aktivitásának növelésével egyenes arányban nő a radioimmun meghatározás érzékenysége. Az AZT alapmolekula tríciumos jelzésével eddig elért legmagasabb (14 Ci/mmól) fajlagos aktivitással szemben jód-125 izotópnak az AZT általunk elkészített származékaiba történő beépítésével elvileg akár 2000 Ci/mmól fajlagos aktivitás is elérhető, ennek megfelelően jelentős érzékenység-növekedés várható. Ismert azonban az is, hogy valamely molekulának a jód-125 izotóp beépítése céljából végzett kémiai átalakítása megváltoztatja annak immunkémiai sajátosságait is. Elméletileg igazolható, hogy ennek következtében a heterológ RIA-ban, ahol a tracer és az inaktív ligandum kémiailag különböznek egymástól - mint eljárásunkban is -, a kétféle antigénre érvényes egyensúlyi állandó döntően megszabja az egyensúlyi elegyben az antitesthez kötött tracer mennyiségét, vagyis az érzékenységet Tapasztalati tény az is, hogy magának a specifikus antitestnek a minősége nem szabályozható tetszőlegesen; adott kismolekulájú anyag immunogén származéka ellen az egyes kísérleti állatokból nyert valamennyi antitest elegy más-más minőségű. Ennek következtében a radioligand-antitest egyensúlyi kötés csak a tracer kémiai szerkezetén keresztül szabályozható. Felismerésünk szerint mindezek egyúttal azt jelentik, hogy az (la) és (Ib) képletű jód-125-tel jelzett tracerek különböző minőségi mutatókkal rendelkező antitestekkel úgy kombinálhatók, hogy az AZT radioimmun meghatározásának érzékenysége, a mérési tartomány bizonyos határok között irányítottan változtatható. A találmány tárgya tehát eljárás biológiai minta (szövet, vérplazma, vérszérum, vizelet stb.) 3’-azido-3’-dezoxi-timidin (továbbiakban AZT) tartalmának antigénantitest reakciós meghatározására ismert mennyiségű, hígítási sorozat szerint különböző koncentrációjú AZT és a meghatározandó biológiai közegminták jelenlétében, melynek során megmérjük nagy fajlagos aktivitású nyomjelzett vegyületnek (továbbiakban tracer, vagy radioligandum) specifikus antitesttel való kötődését, és az ismert mennyiségű AZT hígítási sorozat által okozott kötésváltozásból számítjuk a mindenkori közegminta hatóanyagtartalmát, olyan módon, hogy tracerként jód-5 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
