202288. lajstromszámú szabadalom • Eljárás trombin-inhibitorok előállítására
9 HU 202288 B 10 karitást értek el a fenti, csak ligázt alkalmazó módszerhez képest. A találmány tárgya eljárás olyan DNS-ek előállítására, amelyek a deszulfatohirudin strukturgénjét tartalmazzák és gazdasejtekben expresszióra alkalmasak, és amelyek végei vektorokba való beépítést tesznek lehetővé, és azok fragmenseinek előállítására, úgy, hogy a) alkalmasan védett dezoxinukleotidot szilárd hordozóhoz kapcsolunk, b) alkalmas védett di- vagy trinukleotido-. kát állítunk elő a foszfotriészter-módszerrel, c) a hordozóhoz kötött dezoxinukleotidot vagy oligodezoxinukleotidot alkalmas, védett mono- vagy (a b pont szerint előállított) di- vagy trinukleotiddal kapcsoljuk össze a foszfotriészter-módszer segítségével, d) a c) pont szerint előállítható, hordozóhoz kötött, kb. 20-70 bázishosszúságú oligodezoxinukleotidokat a hordozóról lehasítjuk, adott esetben tisztítjuk, a védőcsoportot eltávolítjuk és az 5’-végen a szabad hidroxicsoportot foszforiláljuk, el) a kódoló és a komplementer szálból származó, egyenként kb. 20-70 bázishosszúságú, legkevesebb 3, előnyösen 8-15 átfedő bázispárt tartalmazó két oligodezoxinukleotidot anellálunk és a négy dezoxinukleozid-trifoszfát jelenlétében DNS-polimerázzal kettős szálú DNS-szegmensekké (a deszulfatohirudin-gén fragmenseivé) egészítjük ki, és adott esetben a d) eljáráslépés szerint foszforilált alkalmas végekkel rendelkező két kettős szálú DNS-szegmenst ligázzal deszulfatohirudin struktúrgénné kapcsolunk össze, vagy 2 kapott kettős szálú DNS-szegmenst alkalmas vektorokba szubklónozunk, majd a d) eljáráslépés szerint foszforilálunk és ligázzal deszulfatohirudin struktúrgénné kapcsolunk össze, vagy e2) alternatív módon a kódoló és a komplementer szálból származó, kb. 20-70 bázishosszúságú, és egyenként legkevesebb 3, előnyösen 8-15 átfedő bázispárt tartalmazó két oligodezoxinukleotidot anelláljuk, a négy dezoxinukleotid-trifoszfát jelenlétében DNS-polimerázzal feltöltünk és ligázzal deszulfatohirudin struktúrgénné kapcsolunk ÓBSze. A találmány szerinti eljárás önmagában ismert, azonban a hirudin aminosavszekvenciáját kódoló DNS előállítását csak a feltételek alkalmas kombinációja és a találmány lényeges újításai teszik lehetővé. Az a) lépésben nagyszámú szilárd hordozóanyag, így különböző térhálósodású, és duzzadóképességű polisztirol, poliakrilamid, poliakrilamid-kopolimer, szervetlen anyagra, igy kovaföldre, kovasavgélre vagy aloxra vitt poliamid vagy funkcioanalizált szilán alkalmazható. A találmány egy előnyös kiviteli formájában szilárd hordozóanyagként térhálósított polisztirolt alkalmazunk, amit egy .spacer'-en, igy 1-5 poláros kétértékű funkciós csoporttal, például imino-, oxo-, tío-, oxo-karbonil- vagy amido-karbonil-csoporttal megszakított 2-12 szénatomos alkiléncsoporton keresztül önmagában ismert módon az 5’-hidroxilcsoporttal alkalmasan védett dezoxinukleotiddal összekapcsolunk. Különösen előnyös az (V) általános képletű 5’-helyzetben és adott esetben a bézisrészben védett nukleozidok - a képletben R1 jelentése savval lehasitható védőcsoport, igy triaril-metil-védöcsoport, például 4-metoxi-tritil- vagy 4,4’-dimetoxi-tritil-csoport vagy trifróvidszénláncú-alkil)-szilil-védőcsoport, például terc-butil-dimetil-szilil-csoport és B jelentése adott esetben védett bázis, a tímil-, citozil-, adenil- vagy guanilcsoport közül az egyik - reakciója borostyánkősavanhidriddel adott esetben bázisok, így piridin, trietil-amin vagy dimetil-amino-piridin jelenlétében, amit a 0,5-2% divinil-benzollal térhálósított, amino-metilezett polisztirollal való és karbonsavmaradék aktiváló reagensekkel, előnyösen N-hidroxi-szukcinimiddel vagy p-nitro-fenollal és vizelvonószerek, igy karbodiimid, például diciklohexil-karbodiimid segítségével lefolytatott reakció követ (1. ábra). A reagéltatást inert, aprotonos oldószerben, például piridinben, tetrahidrofuránban, dioxánban, etil-acetátban, kloroformban, metilén-kloridban, dimetil-formamidban vagy dietil-acetamidban vagy ezek elegyében, szobahőmérsékleten vagy kissé növelt vagy csökkentett hőmérsékleten, például kb. -10- -50 °C-on, előnyösen szobahőmérsékleten, vízelvonószer jelenlétében, alacsony hőmérsékleten is, például 0 °C-on végezzük. A di- vagy tri-nukleotidok találmány szerinti előállításában a b) lépés (2. ábra) szerint az (V) általános képletű ö’-helyzetben és adott esetben a bázisrészben védett nukleozidokat - a képletben R1 és B jelentése a fenti - (VII) általános képletű aktivált foszforsav-éezterekkel - a képletben X1 és X2 egymástól függetlenül hidroxicsoportot vagy abból levezetett sókat, halogénatomot, imidazolil-, 1,2,4-triazol-l-il-, tetrazolil- vagy 1- benztriazolil-oxi-csoportot és X2 kiegészitőleg 2-ciano-etil-oxi-, 2-trihalogén-etil-oxi-, 2- arilszulfonil-etil-oxi-, 2-(rővidszénláncú alkil)-tio-etil-oxi-, 2-aril-tio-etil-oxi- vagy 2- -(4-nitro-fenil)-etil-oxi-csoportot is jelent, és R2 jelentése bázissal vagy nukleofil reagenssel, igy ammónium-hidroxiddal, tiofenoláttal vagy aril-aldoximáttal lehasitható védőcsoport, így adott esetben halogénatommal, nitro- és/vagy rövidszénláncú alkilcsoporttal szubsztituált fenilcsoport, metilcsoporttal vagy adott esetben nitrocsoporttal szubsztituált benzilcsoport, vagy fémionnal lehasitha-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
