202288. lajstromszámú szabadalom • Eljárás trombin-inhibitorok előállítására

7

HU 202288 B

8

A, T, G, C jelentése az (I) általános képletnél megadott és jobb megértés kedvéért megadtuk a triplettek által kódolt aminosavakat és a restrikciós enzimek hasitási helyeit.

A találmány a deszulfatohirudint kódoló 5 DNS fragmenseire is vonatkozik.

A találmány továbbá a deszulfatohirudin-gén kettős szálú fragmenseire vonatkozik, különösen azokra, amelyeknek a végei restrikciós enzimekkel hasíthatok. A hirudin- 10 -gén ilyen kettős szálú DNS-fragmensei különösen 30-70 bázispárt tartalmaznak.

Például a találmány vonatkozik a III (Fi) és IV (Fz) általános képletű DNS-fragmensekre. 15

MetValValTyrThrAspCysThrGluSerGlyGlnAsnLeuCysLeuCysGluGly

CTGGAATTCATGGTTGTTTACACCGACTGCACCGAATCTGGTCAGAACCTGTGCCTGTGCGAAGGT

GACCTTAAGTACCAACAAATGTGGCTGACGTGGCTTAGACCAGTCTTGGACACGGACACGCTTCCA

(EcoRI)

SerAsnValCysGlyGlnGlyAsnLysCysIleLeuGlySer

TCTAACGTTTGCGGTCAGGGTAACAAATGCATCCTGGGTTCTG

AGATTGCAAACGCCAGTCCCATTGTTTACGTAGGACCCAAGAC

(EcoRI I)

IleLeuGlySerAspGlyGluLysAsnGlnCysValThrGlyGluGlyThrProLysPro

GATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTTACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCG

GTAGGACCCAAGACTGCCACTTTTTTTGGTCACGCAATGGCCACTTCCATGGGGCTTTGGC

(ÉcoRII)

GlnSerHisAsnAspGlyAspPheGluGluIleProGluGluTyrLeuGlnNON

CAGTCTCACAACGACGGTGACTTCGAAGAAATCCCGGAAGAATACCTGCAGTAGGATCCTG

GTCAGAGTGTTGCTGCCACTGAAGCTTCTTTAGGGCCTTCTTATGGACGTCATCCTAGGAC

(BamHI)

A találmány a deszulfatohirudin-gén egyes szálú fragmenseire is vonatkozik, különösen azokra, amelyek kémiai és/vagy enzimatikus módszerekkel deszulfatohirudin-génné illeszthetők össze. A találmány húsznál több, különösen 20-70 nukleotidot tartalmazó egyes szálú DNS-fragmensekre is vonatkozik.

A találmány előnyösen a példákban leirt egyes és kettős szálú DNS-fragmensekre vonatkozik.

A DNS-szintézis módszereit S.A. Narang (3) foglalta össze. Az ismert szintézistechnikák mintegy 20 bázis hosszúságú polinukleotidok előállítását teszik lehetővé jó kitermeléssel, nagy tisztaságban és viszonylag rövid idő alatt. A foszfodiészter módszerrel (4), a még hatékonyabb foszfotriészter módszerrel (5) vagy a foszfit-triészter módszerrel (6) alkalmas védett nukleotidokat kapcsolunk össze egymással. Az oligo- és polinukleotidok szintézise a szilárdfázisú módszerrel egyszerűsíthető, amelyben a nukleotidláncot alkalmas polimerhez kötjük. Itakura és munkatársai (7) a szilárdfázisú szintézisben egyes nukleotidok helyett foszfo-triészter módszerrel kapcsolt trinukleotidokat alkalmaznak, amelyek Így rövid idő alatt és jó kitermelés_sel például 31 bázist tartalmazó polinukleotiddá kondenzáltathatók. A tulajdonképpeni kettős szálú DNS kémiailag előállított rövid 40 szegmensekből enzimatikusan állítható össze. Khorana és munkatársai (8) ehhez mindkét DNS-szálból származó átfedő polinukleotid-szekvenciákat alkalmaznak, amelyek helyes elrendezését a bázispárosodás biztosítja, és 45 utána ezeket a DNS-ligáz enzim kémiailag összekapcsolja. További lehetőséget jelent az, ha mindkét DNS-szálból származó, rövid átfedő szegmenst tartalmazó egy-egy polinukleotid-szekvenciát a négy szükséges dezoxinuk- 50 leotid-trifoszfát jelenlétében DNS-polimerázzal, például DNS-polimeráz I-gyel, a polimeráz I Klenow-frag mensé vei, T« DNS-polimerázzal vagy AMV (avian myeloblastosis virus) reverz transzkriptázzal inkubálunk. Eközben 55 a bázispárosodás a két polinukleotid-szekvenciát a helyes elrendezésben tartja össze és azt az enzim a szükséges nukleotidokkal teljes kettős szálú DNS-Bé egészíti ki (9). Itakura és munkatársai (10) leírják, hogy er- 60 re az elvre alapozva DNS-polimeráz I (Klenow-fragment) jelenlétében 4 kémiailag szintetizált 39-42 bázis hosszúságú fragmensból a humán leukocita-interferon cCz-gén 132 bázispár hosszúságú szegmense állítható össze, 65 mimellett a kémiai szintézisben 40%-os megta-6