202288. lajstromszámú szabadalom • Eljárás trombin-inhibitorok előállítására
53 HU 202288 B 54 A hiru din-aktivitás kimutatása Kb. 5-10 pl mintát, amely hiru din-aktivitású polipeptidet (vö. 18. példa) 1 cm2 nitrocellulóz-papírra (NC) (BIORAD) cseppentünk és 30 percig szobahAmérsékleten szárítjuk. Utána az NC-t 1 órán át 37 °C-on 3% szérumalbumin, 0,01 M Tris.HCl (pH = 8) és 0,9% NaCl összetételű oldatban inkubáljuk. Ezt követően az NC-t 0,01 M Tris.HCl (pH = 8) és 0,9% NaCl összetételű oldatban 30 percig mossuk. Az oldatot 5-ször váltjuk. Utána a mosott NC-t 2 órán át 25 °C-on 2 Mg/ml hirudin elleni antitestet (nyúlból előállított, vagy monoklonális antitest) tartalmazó 3% szérumalbumin, 0,01 M Tris.HCl (pH = 8) és 0,9% NaCl összetételű oldattal kezeljük. Utána az NC-t a fenti módon mossuk. Utána az NC-t 2-3 órán át 25 °C-on 0,2 uCi/ml mI-fehérje A-t (faji. aktivitás 89,8 pCi/mg) (NEN) tartalmazó 3% szérumalbumin, 0,01 M Tris.HCl (pH =8) és 0,9 3 NaCl összetételű oldattal kezeljük. Utána az NC-t a fenti módon újból mossuk, szárítjuk és - számlélóban/Multi Gamma, 1250 gamma counter, LKB, Wallace/ meghatározzuk a kötött radioaktivitást, ami az NC-n levő hirudin-aktivitá6Ú polipeptid mértéke. Egy alternativ eljárásban a mintát SDS-poliakrilamid-gélelektroforózisnek (PAGE) vetjük alá. A PAGE-elektroforetogrammot elektro-blottinggal NC-ra visszük át. Ezutána az NC-t a fenti módon kezeljük és/vagy egy éjszakán át röntgenfilmmel (Fuji) autoradiografáljuk. Az NC-n a hirudin-aktivitású polipeptidet tartalmazó helyek a filmen fekete foltokként jelennek meg. 19. példa 20. példa A deszulfatohirudin izolálása és tisztítása trombin-oszlop segítségével a) A polipéptidoldat előállítása a trombin-oszlophoz 150 ml táplevest (a 18. példa szerint kapottat) 4 °C-ra lehűtünk és a sejteket centrifugálással (5000 f/p, 15 perc, Sorvall RC 3B) elválasztjuk. A tiszta felülúszó nem tartalmaz hirudin-aktivitást. Ezt követően a sejteket 12 ml oldó pufferben (50 mM Tris.HCl (pH = 8), 30 mM NaCl] szuBzpendáljuk. Ehhez az elegyhez 15 mg lizozimot (Boehringer) adunk és utána 30 percen át 4 °C-on tartjuk. Utána a sejteket négyszeri lefagyasztással folyékony nitrogénben és ezt kővető 37 °C-ra való felengedéssel elroncsoljuk. Ezt követően 30 percen ét 16 000 f/p-en 4 °C-on centrifugáljuk. A felülúszó tartalmazza a hirudin-aktivitást. A felülúszóban (15 ml) 7,7 g szilárd ammónium-szulfátoi oldunk. A zavaros elegyet 4 °C-on 30 percen állni hagyjuk és utána centrifugáljuk (ld. fent). A nedves üledéket 1 ml 0,05 mM Tris.HCl (pH = 8) puff er ben oldjuk és megkapjuk a kívánt polipeptidoldatot. b) A hirudin tisztítása trombin-oszlopon A trombin-oszlopot (4 ml ágytérfogat) 0,05 M Tris.HCl pH = 8 pufferei egyensúlyba hozzuk. A fenti polipeptidoldatot 0,5 ml-eB adagokban 4 °C-on visszük fel a 7 ml/óra átfolyási sebességű oszlopra. Utána 25 ml 0,05 M Tris.HCl (pH = 8) pufferrel mossuk. Az első frakciók tartalmazzák a nem adszorbeólt polipeptideket, ezeket eldobjuk. Ezt követően az oszlopot 10 ml 1,5 M benzamidin (Mere) (vő. 25), 0,05 M Tris.HCl (pH = 8) öszszetételű oldatban mossuk és a kapott frakciókat a trombin-teszttel (15) vizsgáljuk hirudin-aktivitásra. A polipeptideket tartalmazó frakciókat OD280 méréssel határozzuk meg. A 25. és 26. frakciók tartalmaznak hirudin-aktivitást; ezeket -20 °C-on tartjuk vagy a további feldolgozásig jeges fürdőben. A hirudin-aktivitás a 25. frakcióban 20 Mg/ml és a 26. frakcióban 52 Mg/ml. Utána a frakciókat dializáljuk vagy Sephadex G25-ón (Pharmacia) sómentesitjük. A termék SDS-poliakrilamidgél-elektroforézise (24) kb. 7000-8000 Dalton molekulasúlyt és ennek egész-számú többszöröseit (oligomerek) adta. c) A trombin-oszlop előállítása Affi-Gel 10-et (Bio-Rad) a gyártó adatai szerint hideg desztillált vizzel és pH = 8,5-ős kapcsolópufferrel (0,1 M NaHCCb/NazCOa-oldat) mossuk. A gél kapcsolópufferrel készített (4 ml) 50%-os szuszpenzióját műanyagcsőbe visszük, azonos mennyiségű tisztított trombin-oldattal (120 mg 4 ml kapcsolópufferben) (Calbiochem) elegyítjük és egy éjszakán át 4 °C-on forgatjuk. Utána a gélt kapcsolópufferrel mossuk. A fennmaradt szabad aktiv helyeket úgy blokkoljuk, hogy a gél ml-ként 0,1 ml 1 M etanol-amin-HCl-dal (pH = 8,0) kezeljük 3 órán át 4 °C-on, majd foszfátpufferrel készített, gél ml-ként 10 mM nátrium-azidot tartalmazó sóoldattal mossuk és abban tartjuk 4 °C-on. A kapcsolás fokát 280 nm-en végzett extinkcióméréssel határozzuk meg és ez 15*30 mg hirudin/ml gél. Az affinitás-oszlop készítéséhez 4 ml kapott trombin gélt alkalmazunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 29
