202288. lajstromszámú szabadalom • Eljárás trombin-inhibitorok előállítására
55 HU 202288 B 56 Különböző E.coli törzsek transzformációja a pML310 plazmiddal és a transzformált gazdasejtek tenyésztése A lOd) példában leírttal analóg módon az E.coli JA221, E.coli LM1035 és E.coli W3110 102 törzseket a pML310 plazmiddal transzformáljuk. A transzformált kolóniákat a lOe) példában leirt módon vizsgáljuk az Fi-Fí-DNS előfordulására. 5, 3, illetve 5 pozitív kolóniát kapunk, amelyek a következő jelöléseket kapják: E.coli JA221/pML310/l E.coli JA221/pML310/2 E.coli JA221/pML310/3 E.coli JA221/pML310/4 E.coli JA22l/pML310/5 E.coli LM 1035/pML310/l E.coli LM 1035/pML310/2 E.coli LM 1035/pML310/3 E.coli W3110 A 102/pML310/l E.coli W3110A 102/pML310/2 E.coli W3110A 102/pML310/3 E.coli W3110 A 102/pML310/4 E.coli W3110 A 102/pML310/5 Az említett kiónokat módosított M9-kö- 37 21. példa zegben tenyésztjük, amelynek a következő: az összetétele Na2HP0«-7H20 9 g KH2PO4 3 g NaCl 0,5 g NH4CI 3,5 g CaCl2-2H20 0,015 g MgS04-7H20 0,25 g kazein-hidrolizátum 7,0 g élesztőkivonat 5,0 g Bi vitamin 0,0099 g vas(III)-citrát MOPS (3-morfolino-propán-0,006 g-1-szulfonsav) 34,0 g glükóz 20,0 g ampicillin 0,1 g 37 °C-on és 180 f/p-en addig folytatjuk a tenyésztést, amíg a baktériumszuszpenzió optikai sűrűsége (OD623) kb. 1-et el nem ér. Ezt követően a sejteket (5 ml tenyészetből) összegyűjtjük és a baktériumokat 0,5 ml 50 mM Tris.HCl (pH = 8) és 30 mM NaCl öszszetételű oldatban újraszuszpendáljuk. Utána a szuszpenziót 1 mg/ml lizozim (Boehringer) koncentrációra állítjuk és 30 percre jég közé helyezzük. A szuszpenzió folyékony nitrogénben történő váltakozó lefagyasztásával és 37 °C-ra való felengedésével a baktériumokat elroncsoljuk. Ezt a folyamatot ötször ismételjük. Utána az elegyet 30 percen át 16 000 f/p-en 4 °C-on centrifugáljuk. Mindegyik kiónt megvizsgáljuk hirudin-aktivitású polipeptid képződésére oly módon, hogy a trombin gátlást (15) mérjük. Mindegyik baktériumkivonatban megállapitottunk hirudin-aktivitást (300-600 ng/ml tenyészlé). Például a következő hirudin-aktivitásokat mérjük: Törzs Hirudin-aktivitós (Mg/1 tápoldat) E.coli LM1035/pML310/l 300 E.coli JA221/PML310/1 500 E.coli W3110 A 102/pML310/l 600 22. példa A transzformált E.coli W3110 A 102/pML310/l törzs fermentálása 5000 literes fermentorban és a tápleves feldolgozása A 21. példában leírttal analóg módon egy 5000 1-es fermentorban 3000 1 módosított M9 táptalajon. E.coli W3110 A 102/pML310/l-sejteket tenyésztünk, míg a szuszpenzió kb. 10-13-as optikai sűrűséget (0D«3) el nem ér. A táplevest (pH = 7,4) 10 °C-ra hűtjük, és a sejteket oC-Laval BRPX-207 iszaptalanitó berendezéssel kezeljük. A tiszta felülúszó nem tartalmaz hirudin-aktivitást, ezt eldobjuk. Az iszaptalanitás folyamán az iszapteret A oldópufferei (50 mM Tris.HCl, 30 mM NaCl, HCl-val pH = 8-ra állítva) folyamatosan rész-iszaptalanítjuk és végül a centrifugacsésze tartalmát (7 1) oldópufferrel való teljes iszaptalanitás közben kiürítjük. A kapott sejttömeget pufferrel 375 1-re állitjuk, a pH-ja 7,6. 5-10 °C-ra való hűtés után a szuszpenziót Dyno-malmon (Typ KD5) vezetjük keresztül, ami 4,2 1 0,5-0,75 mm átmérőjű üveggyönggyel van megtöltve. Ezzel elroncsoljuk a sejteket. Az igy kapott szuszpenziót ecetsavval 2% ecetsavtartalomra (v/v) állitjuk és egy éjszakán át 10 °C-on keverjük. A 3,9 pH-jú szuszpenziót a fenti technikával iszaptalanitjuk. A 300 1 tiszta felülúszót ejtőfilmbepárlóban (teljesítmény 60 1 viz/óra) 35 1-re koncentráljuk. Az enyhén zavaros koncentrátumot centrifugáljuk és az így kapott tiszta felülúszót GR 81 PP membránnal (2,5 m2 felület) felszerelt DDS = Láb 35 ultraszűrő berendezésben 2% ecetsavval szemben diafiltráljuk. A végtérfogat 31 1. A tiszta fehérjeoldat 2 1-es alikvotját 96 1 ágytérfogatú Sephadex G50 oszlopra (KS 370 Pharmacia) visszük, mimellett az oszlopot 2% ecetsavval hozzuk egyensúlyba. A 15 1 eluátumban kapott főfrakciót ultraszűréssel tőményítjük, majd vízzel szemben diafiltráljuk. A kapott tiszta, vizes oldatot liofilizáljuk. A feldolgozást a következő példákbanleírt módon végezhetjük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 30
