202288. lajstromszámú szabadalom • Eljárás trombin-inhibitorok előállítására
40 HU 202288 B pon koncentráljuk és eluálás után et&nolos kicsapással izoláljuk. A deszulfatohirudin-gén szerkezete a kővetkező: CTGGAATTCATGGTTGTTTACACCGACTGCACCGAATCTGGTCAGAACCTGTGCCTGTGCGAAGGT GACCTTAAGTACCAACAAATGTGGCTGACGTGGCTTAGACCAGTCTTGGACACGGACACGCTTCCA TCTAACGTTTGCGGTCAGGGTAACAAATGCATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTT AGATTGCAAACGCCAGTCCCATTGTTTACGTAGGACCCAAGACTGCCACTTTTTTTGGTCACGCAA ACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCGCAGTCTCACAACGACGGTGACTTCGAAGAAATCCCGGAAGAA TGGCCACTTCCATGGGGCTTTGGCGTCAGAGTGTTGCTGCCACTGAAGCTTCTTTAGGGCCTTCTT TACCTGCAGTAGGATCCTG ATGGACGTCATCCTAGGAC A deszulfatohirudin-gén előállítását a négy fragmensból a következő ábra szemlél- 20 teti: 6. ábra: A hirudin-gén előállítása a négy szintetikus fragmensból 39 10. példa egy éjszakán át kicsapjuk. A DNS-csapadékot 50 M1 0,01 M Tris.HCl (pH = 8), 0,1 mM EDTA összetételű oldatban oldjuk és felhasználásig -20 °C-on tároljuk. 1,4 pg (= 3,2 pmól végek) 5 DNS-t kapunk. b) Az Fi-DNS/EcoRI előállítása 24 ng (=1,3 pmól végek) kémiailag 10 szintetizált Fi-DNS-t (lásd 8. példa) 5 egység EcoRl restrikciós endonukleázzal (Biolabs) 50 pl 100 mM Tris.HCl (pH = 7,5), 50 mM NaCl és 100 Mg/ml zselatin összetételű oldatban 30 percen át 37 °C-on emésztünk. Utána 15 az oldathoz 0,06 Mg (= 0,14 pmól végek) linearizált pBR322/EcoRl/Pvu II vektort (lásd 10a. példa) adunk. Ezt követően az enzimet 65 °C-on való 10 perces melegitéssel inaktiváljuk, az oldatot TNE-re állítjuk és enol/kloroformmal extraháljuk. A DNS-t alkohollal kicsapjuk. A kicsapott DNS-t alkohol alatt -20 °C-on további feldolgozásig tároljuk. c) A pBR322/EcoRI/PVu II vektor-DNS kap-25 csolása az Fi-DNS/EcoRI-sel és pML300 plazmid megszerkesztése A deszulfatohirudin-gén Fi-fragmensét (1. ábra) tartalmazó pML 300 plazmid előállítása a) A linearizált pBR322(EcoRI)Pvu vektor előállítása 5 Mg pBR322 plazmid-DNS-t 5 egyBég PVU II restrikciós endonukleázzal (Biolabs) 35 100 Mg/ml zselatint tartalmazó oldat 200 ml-ében 1 órán át 37 °C-on emésztünk. Utána az oldatot 100 mM Tris. Hcl-re (pH = 7,5), 50 mM NaCl-re állítjuk és a DNS-t 30 egység Eco Rí restrikciós endonukleázzal (Biolabs) 2 40 órán át 37 °C-on emésztjük. Utána az oldatot 50 mM Tris-HCl-re pH = 8 állítjuk és 10 Mg/~ ml DNS-koncentráció mellett 2 egység borjúbél alkalikus foszfatázzal (Boehringer) 30 percen át 37 °C-on inkubáljuk. Az enzimet 45 az oldat 60 percen át 65 °C-on való melegítésével inaktiváljuk. Utána az oldatot TNE-re állítjuk, 1 térfogat fenollal és kloroformmal extraháljuk és a megemésztett DNS-t 2 térfogat alkohollal -20 °C-on egy éjszakán át ki- 50 csapjuk. A pBR322 DNS-ből kimetszett vektort (pBR322/EcoRI/Pvu II, 2297 bázispár) Tris-acetát-EDTA pufferben pH = 8 oldott lX-os alacsony olvadáspontú agarózon (Biorad) vá- 55 lasztjuk el a kis DNS-fragmenttől (2067 bázispár). Az agarózgélben a DNS EtBr-os festése után azt a géldarabot, amely a pBR322/ -EcoRI/PvuII vektor (=2297 bázispár) DNS-csíkját tartalmazza, a gélből kivágjuk és 60 65 °C-on 10 perc alatt elfolyósitjuk. Ehhez a DNS-oldathoz 20 térfogat TNE-t adunk, a DNS-t Mueller és munkatársai (19) szerint DE-52 kromatográfiával tisztítjuk, fenol/kloroformmal extraháljuk és a DNS-t -20 °C-on 65 A 10b) példában kapott DNS-csapadékot, amely a két említett DNS-fragmentet tartal- 30 mázzá, 20 pl 50 mM Tris. HC1 (pH = 7,8), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP, 100 Mg/ml zselatin összetételű oldatban oldjuk és 25 egység/ m1 Tí DNS-ligázzal (Biolabs) kezeljük 15 °C-on 3 órán át. Ily módon az oldatban Fi-DNS-t tartalmazó pML300 rekombinált plazmid képződik. d) Az E.coli 11B101 transzformációja a pML- 300 plazmiddal A transzformációhoz szükséges kalciummal előkezelt E.coli HB101 sejteket (GIBCO AG 530 8260 5A katalógusszámon beszerezhető) Mandel és munkatársai (14) által leirt módon állítjuk elő. A c) pont szerint kapott oldatot, amely a rekombinált pML300 plazmidot tartalmazza, 10 percen át 65 °C-on melegítjük, hogy a T« DNS-ligázt inaktiváljuk, majd 37 °C-ra lehűtjük. Ebből a reakcióelegyból 10 ul-t adunk 150 mí kalciummal kezelt E.coli HB101 sejthez 10 mM MgCk és 10 mM Tris.HCl (pH = 7,5) összetételű oldatban, 200 pl össztérfogatban. Utána az elegyet 30 percen át jégbe hűtjük, 2 perc alatt 42 °C-ra melegítjük és utána 50 percen át 1 ml L-közegben (vö. 18. példa) 37 °C-on állni hagyjuk. Ezután az elegyet 0,2 ml-es alikvotokban 5 agarlemezre (McConkey-Agar, Difco) szélesztjük, amelyek 60 Mg/ml ampicillint (Serva) tartalmaznak. Az agarlemezeket utána 37 °C-on 16-18 órán át állni hagyjuk. A transzformált E.coli HB101 484 ampicillin-rezisztens kolóniáját kapjuk. 22
