202288. lajstromszámú szabadalom • Eljárás trombin-inhibitorok előállítására
41 HU 202288 B 42 e) Az Fi-DNS-t tartalmazó kolóniák ellenőrzése 470 transzformált kolóniát (lOd. példa) B85 nitrocellulóz szűrőre (Schleicher und Schüll) nyomatunk. Grunstein és Hogness (20) szerint a kolóniákat oldjuk és denaturált DNS-üket rögzítjük a szűrőn. Utána a szűrőt 20 ml [szűrőnként 4xSET (= 30 mM Tris.CHl /pH = 8/, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA oldata], 0,1% (g/tf) Ficoll 400 (Pharmacia), 0,5% SDS, 50 Mg/1 denaturált borjutimusz-DNS összetételű oldatban 4 órán ót 64 °C-on előhibridizáljuk. Ezután a nitrocellulóz-szűrőt 20 ml (szűrőnként) 5xSET (g/tf) Ficoll 400, 0,2% SDS és 50 Mg/ml denaturált borjutimusz-DNS összetételű oldatban 16 órán át 64 °C-on 32P-radioaktiv jelzett mintával (kb. ÍO^IO4 Cserenkov beütés szűrőnként) kezeljük. Mintaként a 46/64 komplementer oligonukleotidot (vö. 6. példa) alkalmazzuk. Ezt követően a szűrőt 2xDET, 0,2% SDS összetételű oldatban szobahőmérsékleten kétszer mossuk, majd kétszer 2xSET, 0,5% SDS összetételű oldatban 60 °C-on (először 30 percig, majd 60 percig). Utána a szűrőt 3 MM papír (Whatman) között szárítjuk és -80 °C-on erósitófóliós (Intensifying screen, Ilford) röntgenfilme (Fuji) helyezzük 1-2 napra. A kapott autodiagram 71 pozitív kolóniát (kiónok) mutat, amelyek a további munkához alkalmazhatók, ezek közül az egyik a pML300 jelölést kapja. 11. példa A deszulfatohirudin-gén Fz-DNS-ét tartalmazó pML305 plazmid előállítása (2. ábra) a) A linearizált pBR322/BamHI/PvuII vektor előállítása d ug pBR322 plazmid-DNS-t 30 egység BamHl restrikciós endonukleázzal 30 percen át 37 °C-on 100 mM NaCl, 6 mM Tris.HCl (pH = 7,9), 6 mM MgCb és 100 Mg/ml zselatin összetételű oldatban emésztünk. Utána az oldathoz 15 egység PvuII restrikciós endonukleózt adunk és 2 órán át 37 °C-on emésztjük. A reakcióelegyet 10 percen át 70 °C-on tartjuk, hogy az enzim inaktiválódjon. Utána a két DNS-fragmentet 1%-os alacsony olvadáspontú agarózon Tris-acetát-EDTA pufferben pH = 8 végzett gélelektroforézissel elválasztjuk egymástól (ld. 10a. példa). A pBR322 BamHI/PvuII vektro (= 2672 bázispár) DNS-sávjait kivágjuk, elfolyósítjuk és Mueller és munkatársai (19) szerint DE-52 kromatográfiéval tisztítjuk. 0,75 /ug (= 1,5 pmól végek) DNS-t kapunk. b) Az Fz-DNS/BamHI előállítása 25 /ug (= 1.3 pmól végek) kémiailag szintetizált Fz-DNS-t (8. példa) 16 egység BamHl restrikciós endonukleázzal (Biolabs) 20 /ul 150 mM NaCl, 6 mM Tris.HCl (pH = 7,9), 6 mM MgClz és 100 Mg/ml zselatin összetételű oldatban 30 percen át 37 °C-on emésztünk. Utána az oldathoz 60 ng (= 96 nmól végek) linearizált pBR322/BamHI/PvuII vektort (11a. példa) adunk, az egész oldatot TNE-re állítjuk, fenol/kloroformmal extraháljuk és a DNS-t 2 térfogat alkohollal kicsapjuk. A kicsapott DNS-t további feldolgozásig -20 °C-on alkohol alatt tároljuk. c) A pBR322/BamHI/PvuII vektor-DNS kapcsolása az Fz-DNS/BamHI-sel és a pML- 305 plazmid megszerkesztése A 11b) példában kapott DNS-csapadékot, amely mindkét említett DNS-fragmentet tartalmazza, 20 m1 50 mM Tris.HCl (pH = 7,8), 10 mM MgClz, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP, 100 Mg/ml zselatin összetételű oldatban oldjuk és 15 egység/Ml T< DNS-ligázzal (Biolabs) kezeljük 15 °C-on 3 órán át. Ily módon az oldatban az F2-DNS-t tartalmazó rekombinált pML- 305 plazmid képződik. d) E.coli HB101 transzformációja pML305 plazmiddal A kalciummal kezelt E.coli HB101 sejtek transzformációja a lOd) példában leírt módon történik. 10 m1 12c) példában kapott reakcióelegyet alkalmazunk. 313 ampicillin-rezisztens kolóniát kapunk. e) Az Fz-DNS-t tartalmazó kolóniák ellenőrzése 65 transzformált kolóniát (lld. példa) a lOe) példában leírt módon vizsgálunk Fr-DNS-re. Radioaktív mintaként a 154/64 komplementer oligonukleotidot (vö. 6. példa) alkalmazunk. Az autoradiogrammon Két pizitiv kolóniát kapunk, egyikük a pML305 jelölést kapja. 12. példa A pML300 és pML305 kiónok jellemzése A pML300 és pML305 rekombináns plazmidok DNS-ét Ish-Horowitz szerint izoláljuk (21). Az inszertált Fi-DNS, F2-DNS nukleotidszekvenciáját Maxam és Gilbert eljárásával határozzuk meg (11). Ebből a célból 10-10 Mg pML300 plazmid-DNS-t EcoRI restrikciós endonukleázzal és 10 Mg pML305 plazmid-DNS-t BamHl restrikciós endonukleázzal hasítunk és a linearizált DNS-eket agarózgélből gélelúcióval izoláljuk (vö. 10a. példa). Utána az izolált 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 23
