202288. lajstromszámú szabadalom • Eljárás trombin-inhibitorok előállítására

37

HU 202288 B

38

-oszlopon választunk el (PRP-l/Hamilton, 250x4,6 mm). Gradiens (A oldat: 0,05 M trietil-ammónium-acetét pH = 7,0; B oldat: A oldat/acetonitril 1:1): 30% B A-ban -»60% B A-ban 20 perc múlva 50 °C-on, 2 ml/perc. A lipofil főcsúcsot (retenciÓ8 idő kb. 14 perc) gyűjtjük, DE52-cellulóz oszlopon (Whatman) koncentráljuk, eluáljuk és etanollal kicsapjuk. A 4-raetoxi-tritil-védócsoport lehasításához a csapadékot 50 ul ecetsav/viz-ben (4:1) oldjuk és 45 percen ét szobahőmérsékleten tartjuk. A reakcióterméket liofilizáljuk, etanollal kicsapjuk és 8%-os poliakrilamid gélen (7 M karbamid) elektroforetikus elválasztással tisztítjuk. A várt DNS-méretnek megfelelő sávokat kivágjuk, a terméket elektroeluáljuk, DE52-cellulóz oszlopon koncentráljuk és az 5’-CATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAACCAGTGCGTTACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCGCAGTCT-3' struktúrájú DNS-t 96/67 etanollal kicsapjuk.

6. példa

Az 5. példával analóg módon állítjuk elő a következő (5’-3’> DNS-fragmenseket:

1/58

CTGGAATTCATGGTTGTTTACACCGACTGCACCGAATCTGGTCAGAACCTGTGCCTGT

46/64 komplementer

CAGAACCCAGGATGCATTTGTTACCCTGACCGCAAACGTTACAACCTTCGCACAGGCACAGGTT

154/64 komplementer

CAGGATCCTACTGCAGGTATTCTTCCGGGATTTCTTCGAAGTCACCGTCGTTGTGAGACTGCGG

7. példa

Az 1/58, 46/64 komplementer, 96/67 és 154/64 komplementer fragmensek foszforilálása

Az S’-végek foszforilálása és radioaktív jelzése (•jf-32P)ATP-vel és T4 polinukleotid-kinázzal (Boehringer) az irodalomban (18) leírt módon történik.

8. példa

Polimerizéció duplex II-vé (a deszulfatohirudin-gén Fi fragmense)

50-50 pmól kinázzal kezelt 96/67 fragmentet és kinázzal kezelt 154/64 fragmens 24 ul vízben oldunk, az oldatot 3 perc alatt 90 °C-ra melegítjük és 5 percen belül 12 °C-ra lehűtjük. 4 ul Endo-R puffer (0,1 M Tris. HC1 pH = 7,5, 66 mM HgCb, 66 mM ß-merkapto-etanol, 0,6 M NaCl) hozzáadása után 10 pl dezoxinukleozid-trifoszfát-eleggyel (dATP, dCTP, dGTP, TTP, egyenként 240'3 M, ammóniával pH = 7-re beállított) és 2 ul (10 egység) DNS-polimeráz I, Klenow-fragmenssel (Boehringer) 30 percen ét 12 °C-on inkubáljuk. A reakciót 3 perces 90 °C-ra való melegítéssel állítjuk le és az elegyet további feldolgozásig -80 °C-on tartjuk. Analóg módon a kinázzal kezelt 1/58 fragmenst és a kinázzal kezelt 46/64 fragmenst duplex I-gyé (a deszulfatohirudin-gén Fi fargmense) reagéltatjuk.

Az I és II duplexek szerkezete a következő:

CTGGAATTCATGGTTGTTTACACCGACTGCACCGAATCTGGTCAGAACCTGTGCCTGTGCGAAGGTTC

GACCTTAAGTACCAACAAATGTGGCTGACGTGGCTT-AGACCAGTCTTGGACACGGACACGCTTCCAAG

TAACGTTTGCGGTCAGGGTAACAAATGCATCCTGGGTTCTG

ATTGCAAACGCCAGTCCCATTGTTTACGTAGGACCCAAGAC

CATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTTACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCGCAGTCTC

GTAGGACCCAAGACTGCCACTTTTTTTGGTCACGCAATGGCCACTTCCATGGGGCTTTGGCGTCAGAG

ACAACGACGGTGACTTCGAAGAAATCCCGGAAGAATACCTGCAGTAGGATCCTG

TGTTGCTGCCACTGAAGCTTCTTTAGGGCCTTCTTATGGACGTCATCCTAGGAC

A deszulfatohirudin-gén Fi és Fz fragmenseinek előállítását a következő ábra szemlélteti:

5. ábra: A deszulfatohirudin-gén Fi és

Fi fragmentjének és az F1-F1- -DNS-nek az előállítása

9. példa

Az 1/58, a kinázzal kezelt 46/64, a kinázzal kezelt 96/67 és a 154/64 fragmensek polimerizációja és összekapcsolása; a deszulfatohirudin-gén előállítása

50-50 pmól 1/58 fragmenst, kinázzal kezelt 46/64 fragmenst, kinázzal kezelt 96/67 fragmentet és 154/64 fragmenst 48 ul vízben oldunk, az oldatot 30 perc alatt 90 °C-ra melegítjük és 5 percen belül 12 °C-ra lehűtjük. 8 ul Endo-R puffer (vö. 8. példa) hozzáadása után 20 ul dezoxinukleozid-trifoszfát-eleggyel (dATP, dCTP, dGTF, TTP, egyenként 0,002 M, ammóniával pH = 7,0-ra beállítva) és 2 ul (10 egység) DNS-polimeráz I, Klenow-fragmenssel (Boehringer) 30 percen át 12 °C-on inkubáljuk. A reakciót 3 perces 90 °C-ra való melegítéssel leállítjuk és a DNS-t fenol/kloroformos extrakció után etanolos kicsapással izoláljuk. A képződött DNS-elegyet 100 ul ligáz-pufferben (66 mM Tris. HC1 pH = 7,5, 6,6 mM MgClz, 10 mM ditiotreitol, 5 mM ATP) oldjuk, 50 egység (2 ul) T< DNS-ligázzal (Biolabs) elegyítjük és 20 órán át 20 °C-on inkubáljuk. A reakciót 5 perces 70 °C-ra való melegítéssel leállítjuk és a DNS-t fenol/kloroformos extrakció után etanolos kicsapással izoláljuk. Az elegy 8% poliakrilamid-gélen (denaturáló) elektroforézissel való elválasztása után a 217 bázispárt tartalmazó kapcsolási terméket elektroeluáljuk, DE52-cellulóz oszlo-5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

21