202288. lajstromszámú szabadalom • Eljárás trombin-inhibitorok előállítására
35 HU 202288 B 36 4. példa A 3. példával analóg módon állítjuk elő a következő (XI) általános képletű, rövidítve Bl, B2, B3 védett trinukleotidokat. A B1, B2, B3 nukleozidokra a következő rövidítéseket használjuk: A = N-benzoil-dezoxiadenozin C = N-benzoil-dezoxicitidin G = N-benzoil-dezoxiguanozin T = timidin. Vegyület R«*> Vegyület Rf»> TTT 0,45 ATG 0,48 TTC 0,55 ACT 0,53 TCT 0,46 ACC 0,48 TAC 0,56 ATT 0,55 TGC 0,44 ACA 0,53 TAG 0,60 AAC 0,46 TŰT 0,42 AAA 0,51 TGA 0,44 AGT 0,45 CTT 0,53 AGG 0,38 CTG 0,46 GTT 0,45 CCT 0,45 GTC 0,44 CCC 0,59 GTG 0,35 CCG 0,47 GCA 0,49 CCA 0,51 GCG 0,48 CAT 0,55 GAT 0,44 CAC 0,51 GAC 0,48 CGC 0,46 GAG 0,48 CGA 0,38 GAA 0,50 CAG 0,44 GGC 0,42 CGG 0,38 GGT 0,46 CGT 0,49 GGG 0,35 GGA 0,44 *>vékonyréteg-kromatogram kovasavgélen diklór-metán/metanolban (9:1). 5. példa A DNS-széU96/67) 96. számú bázistól a 162. számú bázisáig terjedő 67 bázishosszúságú DNS-fragmens szintézise a) A trinukleotid 2-ciano-etil-védócsoportjának lehasitása A 3. vagy 4. példa szerint előállított trinukleotidból 10 unióit- a nedvesség kizárása mellett 60 pl 1:1:1 arányú piridin/acetonitril/trietil-amin-elegyben oldunk. 1 óra eltelte után szobahőmérsékleten 0,7 ml peroxidmentes étert csepegtetünk hozzá és a csapadékot lecentrifugáljuk. A nyers trietil-ammóniumsót 50 pl piridinben oldjuk, 0,5 ml éterrel mégegyszer kicsapjuk, lecentrifugáljuk é6 15 órán át nagyvákuumban szárítjuk. b) A részlegesen védett trinukleotidok kapcsolása a polisztirolgyantához kötött oligon ukleoti d lánccal 1. Metilén-klorid, 2 ml/perc, 4 perc. 2. Metilén- klór id (izopropanol/85:15), 2 ml/perc, 2 perc. 3. 1 M cink-bromid és 0,02 M 1,2,4-triazol me tilén- klorid (izopropanolban/85:15), 2 ml/perc, 2-3,5 perc. 4. Metilén-k lórid (izopropanol/85:15), 2 ml/perc, 4 perc. 5. 0,5 M trietil-ammónium-acetát DMF-ben, 2 ml/perc, 5 perc. 6. Molekulaszitán szárított piridin, 2 ml/perc, 3 perc. 7. Tetrahidrofurán (peroxidraentes, molekulaszitán szárított) 2 ml/perc, 3 perc. 8. Nitrogénáram, 10 perc. 9. 150 pl piridinben oldott 10 pmól GTC trinukleotid (trimetil-ammóniumsó az a) szakaszból) és 8,9 mg (30 pmól) 1- -mezitilénszulfonil-3-nitro-l,2,4-triazol (MSNT) injektálása. 10. 45 °C, 20 perc. 11. Piridin, 2 ml/perc, 4 perc. 12. 5% ecetsavanhidrid és 2,5% 4-dimetil-amino-piridin piridinben, 2 ml/perc, 4 perc. 13. Piridin, 2 ml/perc, 4 perc. 14. Piridin-izopropanol (1:1), 2 ml/perc, 3 perc. Mind a 14 műveletet 21-szer ismételjük, mimellett a 9. műveletnél GTC helyett mindig a trietil-ammóniumsó formában lévő következő trinukleotidot (a/ szakasz) alkalmazzuk: GCA, ACC, GAA, CCC, TAC, AGG, TGA, CGG, TAC, CGT, GTG, CCA, AAA, AAA, TGA, CGG, TGA, TTC, GGG, CCT, CAT. A közepes kapcsolási kitermelés 97%. A végtermék struktúrája a következő: MMT-CATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAACCAGTGCGTTACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCGCAGTCT-polisztirol c) A DNS-fragmens lehasitása a hordozóról és a védócsoportok lehasitása 40 mg (kb. 0,60 pmól) komplementer DNS-szintézisgyantát 96/67 66 mg (0,40 mmól) o-nítro-benzaldoximmal és 50 pl (0,40 mmól) 1,1,3,3-tetrametil-guanidinnel 400 pl 95%-os piridinben 3 órán át 50 °C-on és 12 órán át szobahőmérsékleten tartunk. A piridin nitrogénnel való elfújása után a maradékot 1,6 ml vizes ammóniával (33%) elegyítjük és zárt edényben 24 órán át 50 °C-on tartjuk. Az elválasztott folyadékfázist vákuumban megszabadítjuk az ammóniától és háromszor egyenként 3 ml peroxidmentes dietil-éterrel mossuk. A kismolekulájú alkotórészek Biogel P6 oszlopon (100-200 mesh, 3x66 cm, 0,01 M trimetil-ammónium-hidrogén-karbonát pH = 7,5, 1,5 ml/perc) történő elválasztása után 285 OD-nyi (260 nm) DNST-t izolálunk. Összesen 60 OD mennyiséget HPLC-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 20
