202288. lajstromszámú szabadalom • Eljárás trombin-inhibitorok előállítására
33 HU 202288 B 34 3. példa A trinukleotid szintézise a) A dinukleotid szintézise 7,73 g (15 mmol) 5’-(4-metoxi-tritil)-timidint (MMT-O-T-OH) abszolút piridinnel kétszer bepérolunk. A maradékot 20 ml abszolút tetrahidrofuránban oldjuk és keverés közben és nedvesség kizárása mellett tetrahidrofuránnal készített 0,2 M 2-klór-fenil-di-(l-benztriazolil)-foszfát-oldat 80 ml-éhez csepegtetjük és a reakcióelegyet 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük. A kapott 2- -klór-fenil-l-benztriazolil-5'-(4-metoxi-tritil)-timidin-3’-foszfét oldatát három részre osztjuk. ct) Hidrolízis trietil-ammónium-2-klór-fenil-5’-(4-metoxi-tritil)-timidin-3'-foszfáttá: A 2-klór-fenil-l-benztriazolil-5’-(4-metoxi-tritil)-timidin-3’-foszfát fenti oldatának egyharmadához hűtés közben 100 ml 0,5 M trietil-ammónium-bikarbonátot adunk. 15 perc elteltével diklór-metánnal extraháljuk. A diklór-metános oldatot vízzel mossuk, bepároljuk és cseppenként petroléterrel elegyítjük. A kapott csapadékot vákuumban szűrjük, 1:1 arányú éter-petroléter eleggyel kimossuk és vákuumban szárítjuk. VRK: Rf = 0,35 diklór—metán/metonol/viz (75:— 22:3) elegyben. ü) 2-ciano-etil-2-klór-fenil-5’-(4-metoxi--tritil)-timidin-3 ’-foszfáttá észterezés és a 4-metoxi-tritil védócsoport lehasítása: 2-klór-fenil-l-benztriazolil-5'-(4-metoxi-tritil)-timidin-foszfát-oldat harmadához 1,3 ml 2-ciano-etanolt és 2 ml piridint adunk. Az elegyet egy éjszakán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Az oldószert vákuumban ledesztilláljuk, a maradékot etil-acetátban oldjuk és többször kirázzuk pH = 7-es 0,1 M foszfátpufferrel és vizzel. A szerves fázist szárítjuk, bepároljuk és hexánba csepegtetjük. A csapadékot leszűrjük, 50 ml 7:3 arányú diklór-metán/metanol-elegyben oldjuk és 0 °C-on 3,8 g p-toluol-szulfonsav-monohidrát 75 ml 7:3 arányú diklór-metán/metanol elegygyel készített oldatával elegyítjük. 2 óra elteltével a rekcióelegyet diklór-metánnal hígítjuk és hideg nátrium-hidrogén-karbonátoldattal kirázzuk. A szerves fázist bepároljuk és hexánnal elegyítjük. A kivált 2-ciano-etil-2-klór-fenil-timidin-3'-foszfátot kovasavgélen diklór-metán/metanollal 96:4 kromatografáljuk. ■jf) Kondenzáció 5,-(4-metoxi-tritil)-3'-cia- no-etil- biBztimidin- d inu kleotid dá: 2,2 g 2-ciano-etil-2-klór-fenil-timidin-3'-foszfátot kétszeri abszolút piridines bepárlással vízmentesítünk, 20 ml abszolút tetrahidrofuránban oldjuk és a 2-klór-fenil-l-benztriazolil-5’-(4-metoxi-tritil)-timidin-3’-foszfát-oldat maradék harmadához adjuk. A reakcióelegyhez 18 óra elteltével szobahőmérsékleten jeges hűtés közben 10 ml vizet és 200 ml etil-acetátot adunk. A szerves fázist többször mossuk nátrium-hidrogén-karbonátoldattal és vízzel, nátrium-szulfáton szárítjuk és kis térfogatra bepároljuk. A foszfátrészben és az 5’-, illetve 3’-végen védett dinukleotidot 1:1 arányú éter/hexán-elegyben való becsepegtetéssel csapjuk ki. VRK: Rf = 0,48 diklór-metán/metanolban (9:1). b) A trinukleotid szintézise 1,17 g (1 mmól) fenti teljesen védett dinukleotidot 30 ml 7:3 arányú diklór-metán/metanol elegyben oldunk és jeges hűtés közben 1,9 g p-toluol-szulfonsav-monohidrát 20 ml 7:3 arányú diklór-metán/metanol elegygyel készített oldatával elegyítjük. 2 óra elteltével jéghideg nátrium-hidrogén-karbonátoldatot adunk hozzá és diklór-metánnal extraháljuk. A szerves fázist szárítjuk, bepároljuk és hexánba csepegtetjük. A kivállt nyers szabad 5’-hidroxilcsoportot tartalmazó dinukleotidot kovasavgélen diklór-metánban 2- -8% metanol grádienssel kromatografáljuk. VRK: Rf = 0,33 diklór-metán/metanolban (9:1). Ebből az 5’-hidroxi-dinukleotidból 850 mg-ot és 1,06 g trietil-ammónium-2-klór-fenil-5,-(4-metoxi-tritil)-timidin-3’-foszfátot (vö. a(oC) szakasz) kétszer piridinnel bepárolunk, utána 10 ml abszolút piridinben oldjuk és 560 mg l-mezitilénszulfonil-3-nitro-l,2,4- -triazollal (MSNT) elegyítjük. 2 óra állás után 2 ml jéghideg vizet adunk hozzá és további egy óra elteltével diklór-metánnal extraháljuk. A szerves fázist telített nátrium-hidrogén-karbonáttal és vizzel mossuk, szárítjuk, bepároljuk és éterrel elegyítjük. A kivált trinukleotidot kovasavgélen kromatográfiával tisztítjuk. Rf = 0,45 diklór-metán/metanolban (9:1). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 19
