202288. lajstromszámú szabadalom • Eljárás trombin-inhibitorok előállítására
27 HU 202288 B 28 nal, aminopterinnel és timidinnel (HAT-közeg) kiegészített szelektív tópközegben tenyésztjük. A nem fuzionált mielómasejtek ebben a közegben nem képesek növekedni és ugyanúgy elpusztulnak, mint a normál limfociták. A hibridóma-kultúrák felülúszóinak specifikus antitesttartalmát önmagában ismert eljárásokkal vizsgálhatjuk, például radio-immunassay-vel és agglutinációval. Meglepő módon azt találtuk, hogy a leirt eljárással olyan hibridómasejteket kaphatunk, amelyek deszulfatohirudin és hirudin elleni specifikus antitesteket választanak ki. A kívánt specifitású antitesteket termelő hibridómasejteket a fuzionálással előállított legkülönbözőbb hibridómasejtek keverékéből klónozással szelektáljuk ki. Ehhez önmagában ismert eljárással, amit határhígításnak (.Limiting dilution') neveznek, egyetlen növekvő sejtből kiinduló kultúrákat képezünk. Nagyobb mennyiség előállítása céljából a kívánt specifitású antitesteket termelő hibridóma-sejtklónokat vagy önmagában ismert közegben in vitro tenyésztjük vagy szaporítás céljából egerekbe injektáljuk. A találmány előnyös kiviteli formájában a hibridómasejteket pristonnal (2,6,10,12-tetrametil-pentadekán) előkezelt egerekbe injektáljuk, az ascites folyadékot levesszük és abból ammónium-szulfát-oldattal az antitestet kicsapjuk. A hibridómasejtek segítségével kapott deszulfatohidrudin- és hirudinspecifikus antitesteket önmagában ismert módon immun-affinitás-kromatográfiás oszlopok előállítására alkalmazhatjuk. A találmány előnyös kiviteli formájában alkalmas hordozóanyagot (pufferoldatban szuszpendálva) antitest-oldattal elegyítünk, utána a nem kötődött részeket kimossuk és a hordozóanyag el nem foglalt helyeit blokkoljuk. A hibridómasejtek segítségével kapott deszulfatohirudin- és hirudinspecifikus antitesteket önmagában ismert módon teszt-kittek előállítására alkalmazhatjuk. Ezek különböző módszereken alapuló teszt-kittek lehetnek, például radio-immundiffúzió, latex-agglutináció, foltpróbák, kompetitiv vagy szendvics-radio-immunassay, enzimimmunassay, immun-fluoreszcens vagy immunkémiai enzimtesztek. Az ilyen kittek a különböző eredetű szokásos antitestek mellett enzimekkel vagy fluoreszcens reagensekkel kapcsolt antitesteket is tartalmazhatnak, ezenkívül radioaktiv izotóppal, igy I^S-dal jelzett, vagy enzimmel, például tormaperoxidázzal vagy alkálik us foszfatázzal kapcsolt deszulfatohirudint vagy hirudint, továbbá szubsztrátot, alkalmas puffert, géleket, latexet, polisztirolt vagy más töltőanyagot és hordozóanyagot. Gyógyszerkészi tmények A találmány szerint előállítható ismert (.természetes' hirudin) és új (például deszulfatohirudin) hirudinok értékes farmakológiái tulajdonságokat mutatnak és mint az orvosi piócából extrahálható hirudin, profilaktikus vagy különösen terápiás kezelésre alkalmazhatók. A találmány szerint előállítható deszulfatohirudin-vegyületek biológiai aktivitás szempontjából legalább egyenértékűek a természetes hirudinnal. igy például a deszulfatohirudin Ki-értéke kb. 10-11 M. A deszulfatohirudin tökéletesen trombinspecifikus és a véralvadási rendszer többi proteinázával semmiféle kölcsönhatást nem mutat. Az aktív toxicitás rendkívül alacsony; igy patkányban például 1 g/kg dózis mellett nem állapítható meg semmilyen toxikus tünet. Hasonlóképpen nem figyeltünk meg semmilyen túlérzékenységi és allergiás reakciót sem. A találmány szerinti új deszulfatohirudin-vegyületeket ennélfogva a természetes hirudinnal analóg módon trombózis és tromboembólia kezelésére és profilaxisárga, beleértve a postoperativ trombózis profilaxisát, akut sokk-terápiát (például szeptikus vagy politraumatikus sokknál), diffúz intravascularis koagulopathia kezelését, hemodializist, hemoszeparációt és extrakorporális keringésben alkalmazhatjuk. A találmány tárgya hasonlóképpen olyan gyógyszerkészítmény, amely legalább egy találmány szerinti vegyületet vagy annak farmakológiailag elfogadható sóját tartalmazza, adott esetben valamilyen farmakológiailag elfogadható hordozóval és/vagy segédanyagokkal együtt. Ezeket az összetételeket különösen a fenti javallatokban alkalmazhatjuk, ha azokat például parenterálisan, így intravénásán, intracutan, subcutan vagy intramuszculárisan, vagy helyileg adagoljuk. A találmány hasonlóképpen vonatkozik az új vegyületek és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények alkalmazására az emberi és állati test profilaktikus és terápiás kezelésében, különösen a fenti kórképek esetében, elsősorban a véralvadás gátlására az emberi és állati testen belül és kívül. Az adagolás elsősorban a specifikus feldolgozási formától és a terápia, illetve profilaxis céljától függ. Az egységdózis nagyságát, valamint az adagolás tervét legjobb a mindenkori kóreset egyéni megítélése alapján meghatározni; az ehhez szükséges módszerek a releváns vérfaktorok meghatározására a szakember előtt ismertek. Normál esetben egy injekcióban a találmány szerinti vegyületek terápiás hatású mennyisége 0,005-0,1 mg/kg testtömeg dózistartományban van. Előnyös a 0,01-0,05 mg/kg testtömeg tartomány. Az adagolás intravénás, intramuszkuláris vagy szubkután injekcióban tör5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 16
