202287. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán immun interferon és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
HU 202287 B 2 a számos aminosav jelenléte, a hidrofóbosság, a só-hídképzés stb. következtében oligomer-alakokba, tehát például dimer-, trimer- vagy tetramer-alakban asszociálódhat. A természetes anyag esetében korábban megfigyelt nagy molekulatömeg (6), amelyek nem magyarázhatók meg csupán az aminosav-szekvencia alapján, valószínűleg az ilyen oligomer-alakoknak, valamint a transzláció utáni glikozileződésből származó szénhidrát jelenlétének tulajdoníthatók. 9. Bizonyos gazdasejt-rendszerekben a humán immuninterferon, különösen ha az egy expressziós hordozóba van kötve és a 20 aminosavat tartalmazó szignál-peptidjével együtt kerül expresszióra, érett alakban kiválasztódik a sejtkultúra közegébe, ami rendkívüli módon megkönnyíti a humán immuninterferon kinyerési és tisztítási módszereit. A találmány előnyös kiviteli alakjainak leírása A. Mikroorganizmusok/sejtkultúrák 1. Baktérium-törzsek/promoterek Az alábbiakban leírt munka során mikroorganizmusként többek között a 2 055 382 A sz. brit szabadalmi közrebocsátási iratban ismertetett E. coli K-12 294 törzset (vég A, thi", hsr, khsm+) alkalmaztuk. Ezt a törzset az American Type Culture Collection gyűjteményében ATCC 31446 sz. alatt helyeztük letétbe. Felhasználhatók azonban a leírt eljárásban adott esetben más mikroorganizmus-törzsek is, mint például az ismert E. coli B, E. Coli X 1776 (ATCC 31537). E. col. W 3110 (P, V, protrof) (ATCC 27325), valamint más, legnagyobbrészt különböző elismert mikroorganizmus- gyűjteményekben letétbe helyezett és onnan adott esetben beszerezhető mikroorganizmus-törzsek; vö.: például az American Type Culture Collection (ATCC) törzs-katalógusát, valamint a 2 644 432 sz. német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi közrebocsátási iratot. Az ilyen mikroorganizmusok további példáiként Bacillus-fajok, mint a Bacillus subtilis és más enterobaktériumok, mint Salmonella typhimurium és Serratia marcesans említhetők; mindezekhez olyan plazmidok alkalmazhatók, amelyek képesek a bennük történő replikációra és heterolog génszekvenciák expressziójára. Ezek példáiként megemlítjük a béta-laktamáz és laktóz promotar- rendszereket, amelyeket már előnyösen alkalmaztak heterolog polipeptidek mikrobiológiai termelésének iniciálására és fenntartására. Az ilyen promoter-rendszerek kialakítására vonatkozólag vö.: Chang és munkatársai: Nature 275, 617 (1978), valamint Itakura és munkatársai: Science 198, 1056 (1977). Újabban egy triptofán-alapú rendszert is kifejlesztettek; ennek a trp promoter-rendszer néven ismert rendszernek a kialakítására és szerkezetére vonatkozólag Goeddel és munkatársai: Nucleic Acid Research 8, 4057 (1980), valamint Kleid és munkatársai az 1980. március 24-én bejelentett 133 296 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés leírása tartalmaznak további részleteket. Találtak és alkalmaztak számos másfajta mikrobiális promotert is; ezeknek a nukleotid-szekvenciájára vonatkozólag Siebenlist és munkatársai [Cell 20, 269 (1980)] ismertetnek részletes adatokat, amelyek a szakember számára elegendő kitanítást tartalmaznak ahhoz, hogy ezeket a promotereket funkcionálisan kapcsolhassák plazmid-vektorokba. 2. Élesztő-törzsek/élesztő promoterek Ezeknek az expressziós rendszere is képes hasznosítani az YRp7 plazmidot (14, 15, 16), amely mind E. coli sejtekben, mind pedig a Saccharomyces cerevisiae élesztősejtekben képes szelekcióra és replikációra. Az élesztőben való szelekcióhoz a plazmid a TRP1 gént (14, 15, 16) tartalmazza, amely kiegészíti (triptofán távollétében lehetővé teszi) az élesztő IV kromoszómájában talált gének mutációit (17). Ennél a műveletnél az RH218 törzset (18) alkalmaztuk. (Letétbe helyezve korlátozás nélkül az American Type Culture Collection gyűjteményében ATCC 44076 sz. alatt.) Megjegyzendő azonban, hogy bármely trp 1 sejtet eredményező mutációt tartalmazó Saccharomyces cerevisiae törzs alkalmas környezetül szogálhat az expresszió-rendszert tartalmazó plazmid expressziójához. A felhasználható egyéb törzsek példájaként a pep4-l törzset (19) említjük. Ez a triptofánauxotrof törzs szintén tartalmaz egy pont-mutációt a TRP1 génben. Az élesztő-génből számazó 5’-szegélyező DNS- szekvencia (promoter), ha valamely nem-élesztő gén 5’-oldalára helyezzük, elő képes segíteni valamely idegen génnek az élesztőben történő expresszióját, ha ezt a promotert az élesztő transzformálására alkalmazott plazmidba visszük. A nem-éllesztő génnek az élesztőben való helyes expressziójához a promoter mellett szükség van egy második, a plazmidon a nem-élesztő gén 3’-végéhez illesztett élesztő-szekvenciára is, amely így lehetőséget nyújt a megfelelő transzkripció-terminációra és poliadenilezésre az élesztőben. Ez a promoter megfelelően alkalmazható a jelen találmány szerinti eljárásban, de jól alkalmazhatók más megfelelő promoterek is (lásd alább). A találmány szerinti eljárás előnyös kiviteli alakja esetében az élesztő 3-foszfoglicerát-kináz-génjének 5’-szegélyező szekvenciáját a szerkezeti gén előtti helyre iktatjuk be, majd ezt ismét terminációs-poliadenilezési szignálokat tartalmazó DNS, pédául TRP1 gén (14, 15, 16) vagy PGK-gén (20) követi. Minthogy az élesztő 5’-szegélyező szekvenciája (3’-terminációs élesztő-DNS-sel kapcsolatban lásd alább) elősegítheti idegen gének expresszióját az élesztőben, valószínűnek látszik, hogy bármely nagy mértékben kifejezett élesztő-gén 5’-szegélyező szekvenciái felhasználhatók fontos gén-termékek expreszsziójára. Minthogy bizonyos körülmények között az élesztő 65%-ig fejezte ki oldható fehérjéjét mint glikolitikus enzimet (21) és minthogy ez a magas expressziós szint láthatólag az egyedi mRNS-ek termelésének magas szintjéből (22) ered, feltehetőleg bármely más glikolitikus gén 5’-szegélyező szekvenciái felhasználhatók ilyen expressziós célokra; így az enoláz, gliceraldehid-3-foszfát- dehidrogenáz, hexokináz, piruvát-dekarboxiláz, foszfoffuktokináz, glükőz-6-foszfát-izomeráz, 3-foszfoglicerát-mutáz, piruvát-kináz, triózfoszfát-izomeráz, foszfoglükóz-izomeráz és glükokináz egyaránt alkalmazhatóknak látszanak erre a célra. E gének 3’-szegélyező szekvenciáinak bármelyike ugyancsak alkalmazható lehet a helyes befejezésre és mRNS-poliadenilezésre az ilyen expressziós rendszerben (lásd fentebb). Más alkalmas nagy expresszió-fokú génekként a savas foszfatázok génjei (23), valamint azok a gének említhetők, amelyeknél az expresszió magas szintje az 5’-szegélyező 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
