202287. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán immun interferon és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202287 B 2 tartományokban fellépő mutációknak tulajdonítható (az expressziót növelő mutánsok), ami rendszerint egy TY1 transzponálható elem jelenlétének a következménye (24). Úgy véljük, hogy valamennyi fent említett gént az élesztő-RNS- polimeráz II írja át (24). Lehetséges, hogy az RNS-polimeráz I és ül promoterei, amelyek riboszómális RNS, 5S RNS és tRNS transzkripciójára képesek (24, 25), szintén felhasználhatók az ilyen expressziós rendszerekben. Végül számos élesztő promoter transzkripciós kont-' rollt is tartalmaz, így ezek ki- vagy bekapcsolhatók a tenyésztés körülményeinek változtatásával. Az ilyenfajta élesztő-promoterek példáiként a következő fehérjéket kifejező gének említhetők: alkohol-dehidrogenáz II, izocitokrom-c, savas foszfatáz, nitrogénanyagcserével asszociált lebontó enzimek gliceraldehid- 3-foszfát-dehidrogenáz, valamint a maltóz- és galaktóz- hasznosítást eszközlő enzimek (22). Az ilyen szabályozási tartomány igen hasznos lenne a fehérje-termék expressziójának szabályozására, különösen olyan esetekben, amikor ezek termelődése toxikus hatású az élesztőre. Lehetséges lehetne így egy 5’-szegélyező szekvencia szabályozási tartományának az összehozása egy nagy expressziós-fokú génből származó promotert tartalmazó 5’-szegélyező szekvenciával, - ami egy hibrid promotert eredményezne; úgy véljük, hogy ennek lehetségesnek kellene lennie, minthogy a szabályozási tartomány és a promoter egymástól fizikailag különböző DNS-szekvenciáknak látszanak. 3. Sejtkultúra-rendszerek/sejtkultúra-vektorok A gerincesek sejtjeinek kultúrákban történő szaporítása (szövet- kultúrák tenyésztése) az utóbbi években már rutinmódszerré vált (vö.: Tissue Culture, szerk.: Kruse és Patterson, Academic Press, 1973). Ehhez a COS-7 majomvese-fibroblaszt sejtvonalat alkamazták gazdasejtként humán immuninterferon termelésére (25a). Az itt részletezett kísérletek azonban lefolytathatók lennének bármilyen sejtvonalban amely képes egy kompatibilis vektor replikációjára és expressziójára, így például a WI38, BHK, 3T3, CHO, VERŐ és Hela sejtvonalak bármelyikében is. Az expressziós vektorral szemben csupán az a követelmény áll fenn, hogy legyen egy replikációs kezdőpont és egy promoter az exprimálandó gén előtti helyzetben, az adott esetben szükséges riboszómakötési helyekkel, RNS-kapcsoló helyekkel, poliadenilezési helyekkel és transzkripciós terminátor- szekvenciákkal együtt. Bár az itt leírt kísérletekben az SV40 szekvencia e lényeges elemeit hasznosítottuk, meg kell jegyezni, hogy a találmány nincsen erre az előnyös kiviteli alakra, az itt szereplő szekvenciák alkalmazására korlátozva. így például felhasználhatók lennének más virális (például Polyoma, Adeno, VSV, BPV stb.) vektorok replikációs kezdő pontjai, valamint a DNS-replikáció integrálatlan állapotban funkcióképes celluláris kezdőpontjai is. B. Vektor-rendszerek 1. Érett immuninterferon közvetlen expressziója E. coli sejtekben Az IFN-y E. coli sejtekben érett interferon- polipeptidként (mínusz szignál-szekvencia) történő közvetlen expressziójának elérésére alkalmazott eljárás a korábban humán növekedési hormon (26) és humán leukocita-interferon (1) előállítására alkalmazott eljárásnak egy új változata volt, amennyiben szintetikus (N-terminális) és cDNS szekvenciák kombinációját alkalmaztuk. Az alább ismertetett p69 nukleotid-szekvenciából levezethetően, valamint néhány IFN-a szignál-peptidje és az érett polipeptid közötti ismert hasítási hellyel való összehasonlítás alapján megállapítható, hogy az IFN-y egy 20 aminosavat tartalmazó hidrofób szignálpeptidet tartalmaz, amelyet az érett IFN-y 146 aminosav követ (5. ábra). Amint a 7. ábrából látható, egy BstNl resztrikciós endonukleáz hely célszerűen az érett IFN-y 4- helyzetű aminosavánál helyezkedik el. Két szintetikus oligodezoxinukleotidot szerkesztettünk, amelyek egy ATG transzláció-iniciáló kodont, valamint az 1., 2. és 3. aminosav (cisztein-tirozin-cisztein) kodonját foglalják magukban és egy EcoRI tapadó (kohezív) véget alkotnak. Ezeket az oligodezoxinukleotidokat a p69- nek egy 100 bázis-párból álló BstNl-Pstl fragmentjéhez kapcsoltuk, hogy így egy 1115 bázispárból álló szintetikus-természetes hibridgént építsünk fel, amely az IFN-y terméket kódolja és amely az EcoRI és Pstl resztrikciós helyek által van határolva. Ezt a gént azután beillesztettük a pLelF A trp 103 plazmidba, az EcoRI és Pstl helyek közé, és így a pIFN-y trp 48 expresszió-plazmidot kaptuk. Ebben a plazmidban az IFN- y gén expressziója az E. coli trp promoter irányítása alatt történik. [A pLelF A trp 103 plazmid a pLelF A 25 olyan származéka, amelyben az LelF A géntől távoleső EcoRI hely el lett távolítva. Az említett EcoRI helynek az eltávolítására alkalmazott eljárást az irodalomban (27) más ismertették.] 2. Expresszió élesztőben Valamely heterológ gén, például immuninterferon cDNS élesztőben történő expressziójához egy négy komponenst tartalmazó plazmid vektort kellett megszerkeszteni. Az első komponens az a rész, amely lehetőséget hagy a transzformációra mind E. coli, mind élesztősejtekben és ezért tartalmaznia kell egy szelektálható gént mindegyik organizmusból. (A jelen esetben ez az ampicillin- rezisztencia génje E. coliból és a 77?FT gén élesztőből.) Ennek a komponensnek tartalmaznia kell továbbá egy replikációs kezdőpontot (origót) mindkét organizmusból, hogy plazmidként maradhasson fenn mindkét organizmusban. (A jelen esetben ez az E. coli kezdőpont a pBR322-ből és az arsl kezdőpont az élesztő III kromoszómájából.) A plazmid második komponense egy nagy expressziós fokú élesztőgénből származó 5’-szegélyező szekvencia, amelynek célja, hogy elősegítse a hátrább elhelyezkedő szerkezeti gén transzkripcióját. A jelen esetben az élesztő 3-foszfoglicerát- kináz (GK) génjét alkalmazzuk e komponensként. A fragmens megszerkesztése olyan módon történt, hogy a PGK szerkezeti szekvenciából mind az ATG, mind az ATG előtti 8 bázispár eltávolításra kerüljön. Ezt a szekvenciát egy olyan szekvenciával helyettesítettük, amely mind Xbal, mind EcoRI restrikciós helyet tartalmaz, hogy ez az 5’-szegélyező szekvencia kapcsolódhasson a szerkezeti génhez. A rendszer harmadik komponense egy szerkezeti gén, amely oly módon van megszerkesztve, hogy 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
