202286. lajstromszámú szabadalom • Eljárás egy új antibiotikum, az aranorozin és a vegyületet tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202286 B 2 náljuk a következő összetételű termelési tápközeg beoltására: A termelési tápközeg összetétele: szójaliszt 20 g glükóz 30 g CaC03 6 g NaCl 3 g NH4C1 1,5 g KH2PO4 2 g ZnS04.7H20 0,22 mg CaCb 0,55 mg MnCl2.4H20 0,5 mg FeS04.7H20 0,5 mg CuS04.5H20 0,16 mg C0CI2.6H2O 0,16 mg dezstillált víz 11 Ebből a termelési tápközegből 200 ml-es adagokat 1 1-es Erlenmeyer lombikba helyezünk, és 20 percig 121 °C-on sterilizáljuk. A közeg pH-ját az autoklávba történő behelyezés előtt 6,5-re állítjuk be, és az az autoklávos kezelés után 6,0 lesz. A lombikokat lehűtjük, és a fentebb ismertetett oltó-tenyészettel (1 térfogat%) beoltjuk. A fermentálást 72 órán keresztül végezzük rotációs rázógépben 26 "C-on (±1 °C). Az aranorozin termelődését úgy vizsgáljuk, hogy az aktivitását Bacillus subtilis és Aspergillus niger-rel szemben. A fermentálás befejezésével a tápközeget centrifugáljuk, és az aranorozint mind a micéliumból, mind a szűrletből a következőképpen izoláljuk és tisztítjuk. Az aranorozin izolálása és tisztítása: A szűrletet (143 liter, amelyet a mintegy 150 liter tápközeg centrifugálásával kapunk) 6,7-es pH értéknél 50 liter etil-acetáttal extraháljuk. Az extrakciót még egyszer megismételjük, az extraktumokat egyesítjük, és az etil-acetátot csökkentett nyomáson 35 °C-on ledesztilláljuk. A visszamaradó micéliumot (11,3 kg, amelyet a mintegy 150 liter tenyészközegből centrifugálással nyerünk) hasonlóképpen kétszer 30 liter acetonnal extraháljuk. Az extraktumokat egyesítjük, és az acetont csökkentett nyomáson 35 °C-on ledesztilláljuk, a visszamaradó vizes fázist kétszer 3 liter etil-acetáttal extraháljuk. Az etil-acetátos fázisokat egyesítjük, és csökkentett nyomáson 35 °C az etilacetátot ledesztilláljuk. A maradékot a szűrletből visszamaradt extraktummal egyesítjük. A vörösesbarna nyers aranorozin antibiotikumot (196 g) 2 kg szilikagélen (0,149-0,074 mm) kromatografáljuk és kloroform/metanol keverék oldószerrel, amelynek metanoltartalma fokozatosan növekszik, eluáljuk, amíg a kloroform 5 tömeg% metanolt tartalmaz. Az aranorozint 2 és 4 tömeg% metanolt koncentráció között eluáljuk. A félig tisztított aranorozint (68 g) ismét szilikagélen (1,3 kg, 0,064-0,05 mm) kromatografáljuk, és az előzőekben említett kloroform/metanol keverék oldószerrel eluáljuk. Ilyen módon 13 g továbbtisztított aranorozint kapunk. Ezt a terméket ismét szilikagélen kromatografáljuk (650 g, 0,074-0,05 mm) eluálószerként benzol/acetonitril 7:3 arányú keverékét alkalmazva. 4,1 g tiszta aranorozint nyerünk ki, amely fehér szilárd anyag. Ezt az anyagot etil-acetátban feloldjuk és a pigmentnyomok eltávolítására hexánnal kicsapjuk. 2. példa Az Y-30499 kultúra tenyésztése fermentorban az új antibiotikum, az aranorozin fermentációs előállításához 1. lépés: Az oltókultúra előállítása: a) Rázólombikokban: 100 ml 1. példa szerint előállított oltókultúra közeget, amelynek pH-ját előzetesen 6,5-re állítjuk be, előzetesen sterilizált, szélesnyakú 500 ml-es Erlenmeyer lombikokba helyezzük, és 20 percig autoklávban 121 °C-on sterilizáljuk. Lehűlés után néhány platinakacsnyi 1. példa szerint előállított jó spóraképződésű kultúrával beloltjuk. A sterilizálás után a pH érték 6,0. A lombikokat 26 °C-on (±1 °C) 72 órán keresztül rotációs rázógépen 240/perc sebességgel rázatva inkubáljuk. b) Szívópalackokban: Az 1. példa szerint előállított oltókultúra közegből 1 liter egy 5 literes szívópalackba helyezünk, autoklávban 30 percig 121 °C-on sterilizáljuk, lehűtjük és néhány platinakacsnyi 1. példa szerint előállított jó spóraképződésű kultúrával beoltjuk. A tápközeg pH-ja sterilizálás előtt 6,5, utána 6,0. A palackokat rotációs rázógépbe helyezzük, és 26 "C-on (±1 °C) 72 órán keresztül 240/perc sebeséggel inkubáljuk. 2. lépés: Fermentálás: a) Kis méretben: 20 liter 1. példa szerint előállított termelési tápközeget 0,04 tömeg% Desmophen-nel 30 literes rozsdamentes acélfermentorba helyezünk, és ezt 32 percig 122 °C-on llJóxlO4 Pa gőznyomással sterilizáljuk. A sterilizálás előtt a pH értéke 6,5-re állítjuk be, és a sterilizálás után 6,0. Lehűlés után a fermentort 1-3 térfogat% oltókultúrával aszeptikus körülmények között beoltjuk, és 26 °C-on (±1 °C) a növekedéstől és a habképződéstől függően 120-180 fordulat/perc keverés mellett és 6-10 liter/perc levegőztetéssel fermentálunk 72 órán keresztül. b) Nagy méretben: 100 liter 1. példa szerint előállított termelési tápközeget, amelynek pH-ját 6,5-re állítjuk be és amelyhez 0,04 tömeg% Desmophen-t adunk, egy előzetesen sterilizált 150 literes fermentorba helyezünk. A termelési tápközeget itt 121-122 °C-on 32 percig ll,66xl04 Pa gőznyomás mellett sterilizáljuk. A pH érték ezután 6,0. A fermentort 26 °C-ra hűtjük, és 1 térfogat% oltókultúrával aszeptikus körülmények között beoltjuk, és 26 °C- on (±1 °C) 100 fordulat/perc keveréssel és 60 liter/perc levegőztetéssel fermentálunk. Az aranorozin képződését a Bacillus subtilis és Aspergillus niger-rel szembeni aktivitás változásával mérjük. A fermentálást 72 órán keresztül folytatjuk. A tápközeget centrifugáljuk, hogy a micéliumot a szűrlettől elválasszuk, majd mindkettőt az 1. példában leírtak szerint dolgozzuk fel. A kapott aranorozint kémiai és spektroszkópiai módszerekkel elemeztük. A következő eredményeket kaptuk: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
