202281. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szelektálható és önállóan replikálódó rekobináns dezoxi-ribonukleinsav expressziós vektorok előállítására
1 HU 202281 B 2 seket kapunk. Egy ilyen plazmidot (2. ábra: 104) szelektálunk, és ezután az lpp promotertől balra eső EcoRI helyet HindlII hellyé alakítjuk át. 2 pg plazmid (2. ábra: 104) dezoxi-ribonukleinsavat 100 pl EcoRI pufferban 0,2 egység EcoRI restrikciós endonukleázzal kezelünk 10 percen át 37 °C hőmérsékleten. A reakció leállítására 10 percen át 65 °C hőmérsékleten tartjuk az oldatot, majd fenol és kloroform elegyével extrahálunk, és a dezoxi-ribonukleinsavat etanollal kicsapjuk. A terméket 200 pl SÍ nukleáz pufferban oldjuk, ez 1000 egység/ml SÍ nukleázt tartalmaz. A reakciót 1 órán át végezzük 12 °C hőmérsékleten. A reakció leállítását fenol és kloroform elegyével kivitelezett extrakcióval végezzük, a terméket etanollal csapjuk ki. A kapott dezoxi-ribonukleinsavat 10 pl, 20 pikomól foszforilezett HindlII linkért (5’-CCAAGCTTGG-3’; Collaborative Research) és 2 egység T4 dezoxi-ribonmukleinsav ligázt tartalmazó T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz pufferban szuszpendáljuk. 16 órán át 4 °C hőmérsékleten inkubálju az elegyet, majd 10 percen át 65 °C hőmérsékleten tartjuk, és 150 pl, 10 egység HindlII enzimet tartalmazó HindlII pufferral hígítjuk 150 pl végtérfogatig. Az elegyet 2 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd ezután 1% agarózt tartalmazó gélen frakcionáljuk. A legnagyobb csíkot (az egyetlen vágást szenvedett plazmiddal egyenértékű) ismert módon elkülönítjük és tisztítjuk, majd 20 pl, 0,2 egység T4 ligázt tartalmazó, T4 ligáz pufferban oldjuk. A reakcióelegyet 4 °C hőmérsékleten 16 órán át inkubáljuk, majd E. coli HB101 sejteket transzformálunk. A transzformánsokat ampicillin rezisztenciára szelektáljuk, és az ismén módon izolált plazmidokat restrikciós enzim analízisnek vetjük alá. Szelektáljuk az EcoRI-HindlII fragmenst tartalmazó plazmidot (2. ábra: 105) és felhasználjuk klónozó vektorként az lpp gén 3’- régiójának klónozására. 2 pg plazmid (3. ábra: 105) dezoxi-ribonukleinsavat 50 pl Sáli restrikciós pufferban 2 egység Sáli enzimmel kezelünk. A puffer összetétele a következő: 150 mmól nátirum-klorid, 6 mmól trisz-hidro-klorid, pH=7,9, 6 mmól magnézium-diklorid, 6 mmól ßmerkapto-etanol. A reakciót 1 órán át 37 °C hőmérsékleten végezzük, majd 2 egység BamHI enzimet tartalmazó BamHI pufferral 150 pl végtérfogatra hígítjuk. 1 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet, majd 2,5 egység alkalikus foszfatázt adagolunk, és 1 órán át 65 °C hőmérsékleten folytatjuk az inkubálást. A terméket fenol és kloroform elegyével extraháljuk, etanollal kicsapjuk, TEN (lásd előbb) elegyben oldjuk, és felhasználjuk az lpp gén 3’-fragmensének klónozására. Az lpp gén 3’-régióját tartalmazó fragmens előállítására 10 pg pKENI 11 (3. ábra: 101) dezoxi-ribonukleinsavat 200 pl, 10 egység Hpal emzimet tartalmazó alábbi összetételű Hpal pufferban oldunk: 20 mmól kálium-klorid, 10 mmól trisz-hidro-klorid, pH-7,4, 10 mmól magnézium-diklorid és 6 mmól ß-merkapto-etanol. A reakciót 2 órán át 37 °C hőmérsékleten végezzük. A dezoxi- ribonukleinsavat fenol és kloroform elegyével extraháljuk és etanollal kicsapjuk, a kicsapott terméket 10 pl, 20 pikomól foszforilezett Sáli linkért tartalmazó T4 dezoxi- ribonukleinsav ligáz pufferban oldjuk, az oldathoz 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsavat adunk. A linkért az alábbi nukleotid sorrendű: 5’-GGTCGACC-3’, beszerezhető: Collaborative Research. A rteakciót 16 órán át 4 °C hőmérsékleten végezzük. A ligáz inaktiválására 10 percen át 65 °C hőmérsékleten tartjuk az elegyet. A kapott elegyet 10 egység Sáli enzimet tartalmazó Sáli pufferral 100 pl-re hígítjuk, és 1 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután 300 pl térfogatúra hígítjuk 10 egység PvuII restrikciós enzimet tartalmazó, alábbi összetételű PvuII pufferral: 60 mmól nátrium-klorid, 6 mmól trisz-hidro-klorid, pH=7,5, 6 mmól magnézium-diklorid, 6 mmól ß-merkapto-etanol. 1 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk az elegyet, majd a dezoxi-ribonukleinsavat 5% poli-akril-amidot tartalmazó gélen frakcionáljuk. 0,5 pg 950 bázispárból álló fragmenst különítünk el, tisztítunk és oldunk TEN-elegyben. 0,2 pg fragmenst 20 pl T4 dezoxi- ribonukleinsav ligáz pufferban oldunk, amely 20 pikomól foszforilezett BamHI linkért (5’-CCGGATCCGG-3’; Collaborative Research), és 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázt tartalmaz. Az elegyet 16 órán át 4 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A kapott dezoxi-ribonukleinsavat 10 percen át 65 °C hőmérsékleten tartjuk, majd ezután 100 pl BamHI pufferral hígítjuk, a puffer 20 egység BamHI enzimet tartalmaz. 2 órán át 37 'C hőmérsékleten inkubáljuk az elegyet, és ezután 5% poliakrilamidot tartalmazó gélen frakcionáljuk a fölös linker molekulák eltávolítására. A kapott 950 bázispárból álló fragmens BamHI és Sáli kohézív végeket tartalmaz, ismert módon tisztítjuk, 20 pl T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz pufferban oldjuk, amely 0,2 pg klónozóvektort (lásd előbb) és 0,2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázt tartalmaz. 16 órán át 4 °C hőmérsékleten inkubáljuk az elegyet, majd a dezoxi-ribonukleinsavval E. coli K12 HB101 sejteket transzformálunk. Az ampicillinre rezisztens transzformánsokból plazmidot izolálunk, és a Sall-BamHI fragmens jelenlétének vizsgálatára ismert módon analizáljuk. Az előállítandó 5,2 kb nagyságú fragmesnt pKEN021 jellel jelöljük (3. ábra: 106). 10 pg pKEN021 plazmidot 37 °C hőmérsékleten 200 pl alábbi összetételű Xbal/BamHI pufferban emésztünk: 150 mmól nátrium-klorid, 10 mmól triszhidro-klorid, pH-8,0, 10 mmól magnézium-klorid, 6 mmól ß-merkapto- etanol. Az emésztést 10 egység BamHI enzimmel végezzük 1 órán át. Ezután 10 egység Xbal enzimmel folytatjuk az emésztést 37 °C hőmérsékleten. A kapott Xbal-BamHI emésztett dezoxi- ribonukleisavat 2,5 egység alkalikus foszfatázzal kezeljük 1,5 órán át 65 °C hőmérsékleten, majd fenol és kloroform elegyével extraháljuk, etanollal kicsapva összegyűjtjük, és további felhasználáshoz 50 pl TEN-pufferban oldjuk (3. ábra: 107). B. A pNM575 plazmid előállítása A humán növekedési hormon génjének kódoló szekvencia részét tartalmazó dezoxi-ribonukleinsav 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
