202281. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szelektálható és önállóan replikálódó rekobináns dezoxi-ribonukleinsav expressziós vektorok előállítására
1 HU 202281 B 2 fragmens forrásaként a ptrpED50chGH800 plazmidot (4. ábra: 108) használjuk [Martial és munkatársai, Science, 205, 602-607 (1979)]. Ezt a fragmenst szintetikusan is előállíthatjuk [Itakura és munkatársai (1977) és Crea és munkatársai (1978)], vagy ismert módon izolálhatjuk [Goodman és munkatársai, Methods in Enzymology, 68, 75-90 (1979)]. Ebben az esetben humán növekedési hormont meghatározó hírvivő ribonukleinsavat izolálunk humán agyalapi mirigyből. A humán növekedési hormon génjének egy részét hordozó ptrpED50chGH800 plazmid egyetlen Smal restrikciós helyet tartalmaza a gén transzlációs terminációs kodonjától jobbra 6 bázispárral. Ezt a helyet BamHI helyre változtattuk, az alábbiak szerint eljárva: 6 pg plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 6 egység Smal enzimmel emésztünk 200 pl alábbi összetételű Smal restrikciós pufferban: 15 mmól trisz-hidro-klorid, pH=8,0, 6 mmól magnézium-diklorid, 15 mmól kálium-klorid és 6 mmól ß-merkapto-etanol. 1,5 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet. Miután az emésztés teljes, fenol és kloroform elegyével extrahálunk, és a dezoxi-ribonukleinsavat etanolos kicsapással különítjük el. A csapadékot 24 pl TEN-elegyben oldjuk. 40 pM foszforilezett BamHI adapter fragmenst (Collaborative Research) adunk 0,5 pg (0,2 pikomól végekre számítva) fenti módon emésztett plazmidhoz 16 pl, 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázt tartalamzó ligáz pufferban. 2 órán át 22 *C hőmérsékleten, majd 16 órán át 4 °C hőmérsékleten és 10 percen át 65 °C hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet. BamHI restrikciós enzimmel ismert módon BamHI kohézív végeket állítunk elő. Az enzim hasítja a linker szekvenciát és a klónozott humán növekedési hormon cDNS szekvencia kezdeténél levő BamHI helyet. így BamHI végekkel rendelkező, 691 bázispárból álló fragmenshez jutunk, ezt 6% poliakril-amidot tartalmazó gélen ismert módon szeparáljuk és kinyerjük. Az elkünönített dezoxi-ribonukleinsav fragmenst ligáljuk 0,2 pg BamHI restrikciós endonukleázzal emésztett és alkalikus foszfatázzal kezelt pBR322 dezoxi- ribonukleinsavval (4. ábra: 102), a ligálást 20 pl, előzőekben megadott összetételű, 0,2 egység T4 dezoxi- ribonukleinsav ligázt tartalmazó pufferban végezzük. 16 órán át 4 °C hőmérsékleten inkubáljuk az elegyet, majd Wensink és munkatársai [Cell., 3, 315-325 (1974)] szerint eljárva E. coli JA221 [NRRL B-15014] sejteket transzformálunk. A transzfománsokat 100 pg/ml ampicillint tartalmazó agar lemezeken szelektáljuk, és a bennük levő plazmidot ismert módon izoláljuk, és ezután restrikciós enzimes és gél-elektroforetikus analízissel azonosítjuk. Az előállított pNM575 jelű plazmid (4. ábra: 109) körülbelül 700 bázispárból álló BamHI fragmenst tartalmaz. Ezt ismert módon sokszorosítjuk további felhasználásra. C. A pNM702 plazmid előállítása Az érett humán növekedési hormon dezoxi-ribonukleinsav szekvenciájában egy FnuDII hely található, az első nukleotidtól 47 bázispámyi távolságban. 25 pg pNM575 dezoxi- ribonukleinsavat 25 egység BamHI enzimmel emésztünk 250 pl BamHI pufferban 1 órán át 37 ”C hőmérsékleten. A BamHI kohézív végekkel rendelkező 691 bázispárból álló fragmenst 6% poliakril-amidot tartalmazó gélről ismert módon izoláljuk és tisztítjuk. A fragmenst tisztítása után a termék 1/3-át (8 pg plazmiddal ekvivalens) 2,5 egység FnuDII enzimmel emésztünk 100 pl alábbi összetételű FnuDII pufferban: 6 mmól nátrium-klorid, 6 mmól trisz-hidro-klorid, pH=7,4, 6 mmól magnézium-diklorid, 6 mmól ß-merkapto-etanol. Az emésztést 37 °C hőmérsékleten végezzük 1,5 órán át. Az 538 bázispárból álló dezoxi-ribonukleinsav fragmenst 6% poliakril- amidot tartalmazó gélen elektroforézist végezve ismert módon izoláljuk. A fragmens tartalmazza az utolsó, 175 aminosavat meghatározó kódoló szekvenciát, és ezután egy transzlációs stop jelet. A foszfo-triészter módszerrel kétszálú dezoxi-ribonukleinsav fragmenst (5. ábra: 110) szintetizálunk, az lpp promoter kapcsolásához a humán növekedési hormont meghatározó kódoló régióval. A kétszálú dezoxi-ribonukleinsav fragmens (5. ábra: 110) az alábbi szekvenciájú: Xbal ' 5 ’ CTAGAGGGTATTAATAATGTTCCCATTGGAT- I I I I I I I 11 11 I 11 I I I II I 11 I I I I I 3 ’ TCCC ATA ATTATTAC AAGGGTA ACCCT- --GATGATGATAAGTTCCCAACCA TTCCC T-, III I I 11 II II I I II I I I I I I I I II I I I --ATACTACTAT T CAAGGGTTGGTAAGGGA-,-TATCCAGGCTTT TTGACAACGCTATG-I III II II I I I II I I I I I I I I II II I -- ATAGGTCCG A A A A ACTGTTGCG ATAC-CTCCG 3’ FunDll I I I I I-GAGGC 5’. A fragmenst az ismert foszfo-triészter módszert használva állítjuk elő, a fragmenst a következő szegmensekből állítjuk össze: 1. CTAGAGGGTAT 2. TAATAATGTTCC 3. CATTGGATGAT 4. GATGATAAGTTCC 5. CAACCATTCCC 6. TTATCCAGGC 7. TTTTTGACAACG 8. CTATGCTCCG 9. CATTATTAATACCCT 10. ATGGGAA 11. CTTATCATCATCATCCA 12. GGTTGGGAA 13. GGATAAGGGAAT 14. GTCAAAAAGCCT 15. CGGAGCATAGCGTT. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
