202281. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szelektálható és önállóan replikálódó rekobináns dezoxi-ribonukleinsav expressziós vektorok előállítására
1 HU 202281 B 2 csapjuk. A kivált dezoxi-ribonukleinsavat 100 pl elektroforetikus pufferban oldjuk és 5% poliakril-amidot tartalmazó gélen frakcionáljuk (az összes gélben 29:1 arányú akril-amid:bisz arányt választunk, kivéve, ha másként nem jelezzük). A gélt 0,5 pg/ml etídiumbromiddal festjük, és a csíkokat hosszú hullámhosszú ultraibolya fényben vizsgáljuk. A gélről elektroelúcióval egy 950 bázispárból álló csíkot izolálunk dialitikus zsákba. A dezoxi-ribonukleinsavat fenol és kloroform elegyével extraháljuk, etanollal kicsapjuk, majd a 2,5 pg-nyi terméket 25 pl TEN-oldatban oldjuk. Ennek összetétele a következő: 10 mmól nátrium-klorid 10 mmól trisz-hidro-klorid, pH-7,4 és 1 mmól nátrium-etilén-dinitrilo-tetraecetsav, (EDTA), pH=8,0. 2 pg mennyiségű, 950 bázispárból álló Hpall fragmenst Alul restrikciós enzimmel kezelünk 200 pl alábbi összetételű pufferban: 50 mmól nátrium-klorid, 6 mmól trisz-hidro-klorid (pH—7,6), 6 mmól magnézium-diklorid és 6 mmól ß-merkapto-etanol. A reakciót 2 órán át 37 °C hőmérsékleten végezzük. Ezután 6% poliakril amidot tartalmazó gélen frakcionáljuk a dezoxi- ribonukleinsavat, és a keletkezett 462 bázispárból álló Alul fragmenst az előzőekben megadottak szerint különítjük el és tisztítjuk. 1 pg 462 bázispárból álló Alul fragmenst 10 pl T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz pufferban oldunk, enek összetétele a következő: 66 mmól trisz-hidro-klorid, pH=7,6, 10 mmól magnézium-diklorid, 10 mmól ditio-treitol, 0,4 mmól adenozin-trifoszfát. Az elegy 150 pmól foszforilezett EcoRI linkért is tartalmaz (5’-GGAATTCC-3’; Collaborative Research), továbbá 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázt. 16 órán át 4 °C-on inkubáljuk a reakcióelegyet, majd 65 °C-on tartjuk 10 percen át, és ezután 100 pl-re hígítjuk, az alábbi összetételű EcoRI pufferral: 100 mmól trisz-hidro-klorid, pH=7,2, 50 mmól nátrium-klorid, 10 mmól magnézium-diklorid, 6 mmól ß-merkapto-etanol. 40 egység EcoRI enzimet adunk az elegyhez, madj 2 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubálunk. Fenol és kloroform elgyével extraháljuk a mintát, és etanollal kicsapjuk. A kivált dezoxi- ribonukleinsavat 20 pl T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz pufferban oldjuk, a puffer 0,1 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázt és 0,1 pl pBR322 (1. ábra: 102) dezoxi- ribonukleinsavat is tartalmaz, amit EcoRI enzimmel linearizáltunk, és ezután alkalikus foszfatázzal kezeltünk. 4 ”C hőmérsékleten 16 órán át ligálunk, majd a kapott dezoxi- ribonukleinsavval ismert módon E. coli K12 HB101 törzset transzformálunk. A transzformánsokat 12 pg/ml tetraciklint tartalmazó agar lemezeken szelektáljuk, és a plazmidokat a rezisztens telepekből gyors alkalikus extrakcióval izoláljuk [Bimbóim és Doly, Nucleic Acids Research, 7, 1513— 1523 (1979)). így 466 bázispárból álló Xbal-BamHI fragmenst tartalmazó plazmidot (1. ábra: 103) kapunk, és ezt használjuk a következő lépésben kiindulási anyagként. 2 pg plazmid (2.ábra: 103) dezoxi-ribonukleinsavat 2 egység HindlII enzimmel kezelünk 50 pl alábbi összetételű reakcióelegyben: 60 mmól nátrium-klorid, 10 mmól trisz-hidro-klorid, pH=7,4, 10 mmól magnézium-diklorid és 6 mmól ß-merkapto-etanol. A reakciót 1 órán át 37 °C hőmérsékleten végezzük. Fenol és kloroform elegyével extraháljuk az elegyet, majd a dezoxi- ribonukleinsavat etanollal kicsapjuk, 200 pl alábbi összetételű pufferban oldjuk ezután: 300 mmól nátrium-klorid, 30 mmól nátrium-acetát, pH=4,25, 1 mmól cink-diklorid és 200 egység SÍ nukleáz (Miles Laboratories). 1 órán át 15 °C hőmérsékleten tartjuk a reakcióelegyet, majd a reakció leállítására fenol és kloroform elegyével extrahálunk és etanollal kicsapjuk a terméket. A kapott dezoxi-ribonukleinsavat 10 pl T4-, dezoxi-ribonukleinsav ligáz pufferban oldjuk, a puf» ferhoz előzőleg 20 pikomól -foszforilezett BamHI linkért (5’-CCGGATCCGG-3’; Collaborative Research) és 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázt adunk. 4 °C hőmérsékleten 16 órán át inkubáljuk az elegyet, majd 10 percen át 65 °C hőmérsékleten tartjuk a ligáz inaktiválására, ezt követően pedig az alábbi összetételű BamHI pufferral 100 pl-re egészítjük ki: a 150 mmól nátrium-klorid, 20 mmól trisz-hidro-klorid, pH=8,0, 10 mmól magnézium-diklorid, és 6 mmól ß-merkapto-etanol. Ez az elegy 20 egység BamHI enzimet is tartalmaz. 2 órán át 37 °C hőmérsékleten tartjuk a reakcióelegyet, majd 1% agarózt tartalmazó gélen tisztítjuk. A gélt festjük, és a 4,5 kb nagyságú nagyobb fragmenst eluálással elkülönítjük, miután fagyasztottuk. Ezután fenol és kloroform elegyével extrahálva és etanollal kicsapva tisztítjuk. A kohézív BamHI végekkel rendelkező tisztított fragmenst 20 pl T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz pufferban oldjuk, ami 0,1 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázt tartalmaz. 16 órán át 4 °C hőmérsékleten ligálunk, majd a kapott dezoxi-ribonukleinsavval E. coli HB101 sejteket transzformálunk. A transzformánsokat ampicillin (Apr) rezisztencia alapján szelektáljuk, 100 pg/ml ampicillin jelenlétében. A telepeket 10 pg/ml tetraciklinnel szembeni érzékenységre vizsgáljuk (Tss). Több ApTcs genotípusú és az előzőekben megadott Bimbóim módszerrel izolált plazmidot vizsgálunk a HindlII hely hiányára, és az egyetlen BamHI hely jelenlétére. EcoRI és Sáli restrikciós endonukleázokkal, egymást követő emésztés után 466 és 305 bázispárból álló fragmen-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
