202281. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szelektálható és önállóan replikálódó rekobináns dezoxi-ribonukleinsav expressziós vektorok előállítására
1 HU 202281 B 2 fentiekben ismertetett módosított és variált szekvenciák előállíthatók. Ezért a találmány nem csupán a példaként, jelen leírásban megadott dezoxi-ribonukleinsav szekvenciára és plazmidokra vonatkozik. A találmány szerinti expressziós vektorokat és módszert több gazda mikroorganizmusban használhatjuk, például az alábbi gram- negatív festődésű prokariota mikroorganizmusokban, például Escherichia coli, E. coli K12, E. coli K12 RV308, E. coli K12 NB101, E. coli K12 C600, E. coli K12 C600 Rlc-Mk-, E. coli K12 RR1, E. coli K12 MM294 és mások. Bár a találmány szerinti eljárás összes kivitelezési változata felhasználható, egyes vektorok és transzformánsok előnyösek. Előnyös vetkorok például a következők: pCZ1920, pJR1.3, pCZll2, pATl, pAT 1.3, pAT2, pAT2.3, pASPl, pASP1.3, pCZ154, pCZ154.3, pCZ156, pCZ156.3, pASP2.3 és pASP2, melyek a következő hormonokat kódolják: plazmid hormon-származék pCZ1920 Met-Lys-Gly-Asn-Ser-Met-Ala-bGH pJRl Met-bGH(Ala az 5-helyzetben) pJR1.3 Met-bGH(Ala az 5-helyzetben) pCZ112 Met-Asp-Asp-Lys-bGH pATl Met-bGH p AT 1.3 Met-bGH pAT2 Met-bGH pAT2.3 Met-bGH pASPl Met-Asp-bGH pASP1.3 Met-Asp-bGH pCZ154 Met-Val-bGH pCZ154.3 Met-Val-bGH pCZ156 Met-Asp-bGH pCZ156.3 Met-Asp-bGH pASP2.3 Met-Asp-bGH pASP2 Met-Asp-bGH Előnyös transzformánsok például az alábbi mikroorganizmusok: E. coli K12 RV308/pCZ1920, E. coli K12 RV308/pJRl, E. coli K12 RV308/pJRl, E. coli K12 RV308/pJR1.3, E. coli K12 RV308/pCZ112, E. coli K12 RV308/pATl, E. coli K12 RV308/pAT1.3, E. coli K12 RV308/pAT2, E. coli K12 EV308/pAT2.3, E. coli K12 RV308/pASPl, E. coli K12 RV308/pASP1.3, E. coli K12 RV308/pCZ154, E.é coli K12 RV308/pCZ154.3, E. coli K12 RV308/pCZl56, E. coli K12 RV308/pCZ156.3, E. coli K12 RV308/pASP2.3 és E. coli K12 RV308/pASP2. Az előnyös csoporton belül az alábbi plazmidok és transzformánsok különösen előnyös tulajdonságokkal rendelkeznek: pCZ112, pCZ154, pCZ154.3, pCZ156, pCZ156.3, pASP2.3 és pASP2, illetve E. coli K12 RV308/pCZ112, E. coli K12 RV308/pCZ154, E. coli K12 RV308/pCZ154.3, E. coli K12 RV308/pCZ156, E. coli K12 RV308/pCZ156.3, E. coli K12 RV308/pASP2.3 és E. coli K12 RV308/pASP2. A témában jártas szakemberek tudják, hogy a találmány szerinti expressziós vektorokat megfelelő gazda-mikroorganizmusok transzformálására használjuk úgy, hogy egy szarvasmarha növekedési hormonszármazék ismert fermentációs körülmények között kifejeződik. A termék rendkívül homogén granulátum alakjában fejeződik ki, és a sejt lizátumból ismert módszerekkel izolálható, a termék pedig felhasználható a tejtermelés fokozására és a szarvasmarha növekedésének általános stimulálására. A felhasználás módjai, a szarvasmarhának adagolandó dózisok ismertek, és a 0085036 számú európai közzétételi iratban olvashatók (7-9. oldal). A továbbiakban példákkal szemléltetjük a találmányt. 1. példa A pNM789B előállítása A. A pKEN021 plazmid és ennek Xbal-BamHl fragmensének előállítása Kiindulási anyagként a pKEN021 plazmid (lásd a 3. ábrán: 106) 5,1 kb nagyságú Xbal-BamHI restrikciós fragmensét használjuk. A pKEN021 plazmid a pKENlll származéka [lásd az 1. ábrán: 101, továbbá Lee és munkatársai, J. Bact., 146, 861-866 (1981) és Zwiebel és munkatársai, J. Bact., 145, 654-656 (1981)], amely plazmid az E. coli CC620 törzsből izolálható (letéti szám: NRRL 15011), és amely 2,8 kb nagyságú fragmensén hordozza a E. coli lipoprotein génjét. A fragmens leírását Nakamura és Inouye adja meg [Cell, 18, 1109-1117 (1979)]. A pKEN021 plazmidban az egyetlen EcoRl és Sáli restrikciós helyek közötti 650 bázispár nagyságú szekvenciát (pBR322 plazmid) olyan szekvenciával helyettesítették, amely az E. coli lipoprotein génjét hordozza. A lipoprotein gén szekvenciája [Nakamura és Inouye (1979)] 462 bázispárból álló Alul fragmenst tartalmaz, a lipoprotein gén első tripletjétői (metionin) az 5’-vég felé haladva, és ez tartalmazza a promoted, az 5’-nem transzlatált szakaszt és a riboszóma kötőhelyet. A transzlációs iniciációs metionin szignál előtt 16 bázispárral helyezkedik el a riboszóma kötőhelyen belül az egyetlen Xbal restrikciós hely. Egyetlen PvuII restrikciós helyet találunk a struktúrgén transzlációs termunációs Módónjától 105 bázispárral balra, ezt BamHI restrikciós hellyé változtatjuk úgy, hogy egy alábbi nukleotid sorrendű, szintetikus dezoxi-ribonukleinsav linkért kapcsolunk hozzá: 5’-CCGGATCCGG-3’. (A linkért az alábbi helyről vásároltuk: Collaborative Research). A BamHI helyet a lipoprotein utolsó 35 aminosavának kódoló szekvenciája, a transzlációs terminációs jel és a hírvivő ribonukleinsav 3'-nem transzlatált régiójának megfelelő szekvencia követi. A pKEN021 plazmid tartalmaz továbbá 850 bázispárból álló, a lipoprotein génnel nem összefüggő szekvenciát, ez az E. coli kromoszómában ettől jobbra helyezkedik el. Ezek a szekvenciák azért vannak jelen, mivel a gén eredeti izolálásakor a módszerek és a rendelkezésre álló restrikciós helyek ezt eredményezték. Az 1., 2. és 3. ábrán megadott sémából kiderül, hogy a pKEN021 plazmid a pKENlll plazmidból származik. Az előállítást az alábbiak szerint végezzük: 50 pg pKENlll (lásd az 1. ábra: 101) dezoxi-ribonukleinsavat 25 egység Hpall restrikciós enzimmel kezelünk 300 pl alábbi összetételű pufferban: 20 mmól trisz-hidro-klorid, pH-7,4, 10 mmól magnézium- diklorid és 6 mmól ß-merkapto-etanol. A reakciót 2 órán át végezzük 37 °C hőmérsékleten. Kétszer 300 pl alábbi összetételű eleggyel extrahálunk: fenol-kloroform 50:50. A vizes fázist elkülönítjük és 2,5 térfogat etanollal és 0,1 térfogat 3 mólos nátrium-acetát-oldattal ki5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
