202281. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szelektálható és önállóan replikálódó rekobináns dezoxi-ribonukleinsav expressziós vektorok előállítására
1 HU 202281 B 2 A linker szekvenciát Itakura és munkatársai (1977) és Crea és munkatársai (1978) szerint állítjuk elő. Ezt a szintézist az 1. példában részletesen szemléltettük. Az E. coli K12 RV308/pCZ156 transzformánsokat megfelelő antibiotikumon TY agaron szélesztjük, és ezután a pCZ156 plazmid termelésére és izolálására ismert módon tenyésztjük. A transzformánsok az SDS gél-elektroforézis, RIA és más vizsgálatok szerint nagymértékben fejezik ki az előzőekben ismertetett Met- Asp-bGH származékot. Mivel a pCZ156 plazmid termoindukálható replikont tartalmaz, amely az indukció körülményei között nem szabályozza a példányszámot, 37 °C hőmérsékleten tenyésztve a sejtek maximális mértékben fejezik ki az adott bGH származékot. 15. példa A pCZ103 plazmid és az E. coli K12 RV308/pCZ103 sejtek előállítása 10 pl alábbi összetételű 10X BstEII reakciópufferban 10 pg pCZIOl plazmidot oldunk: 1,5 mól nátrium-klorid, 60 mmól trisz-hidro-klorid, pH-7,9, 60 mmól magnézium-diklorid, 60 mmól 2-merkapto-etanol és 1 mg/ml borjú szérum albumin. Az elegyhez 2 pl (20 egység) BstEII restrikciós enzimet és 88 pl vizet adunk, majd 2 órán át 60 °C hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet. 0,25 mól nátrium- acetát-oldatot adagolunk, majd fenollal és kloroformmal extrahálunk, és a dezoxi-ribonukleinsavat etanolos kicsapásokkal különítjük el. 0,1 pg BstEII enzimmel emésztett pCZIOl dezoxiribonukleinsavat 100 pl ligáz pufferban oldunk. 100 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázt adagolunk az oldathoz, és 2 órán át 16 °C hőmérsékleten inkubá- 5 lünk. A ligáit dezoxi- ribonukleinsavval E. coli K12 RV308 sejteket transzformálunk. Az E. coli K12 RV308/pCZ103 transzformánsokat kanamicint tartalmazó táptalajon szelektáljuk, és a plazmid dezoxiribonukleinsavat restrikciós enzimes analízisei azo- 10 nősítjük. A pCZ103 plazmidot a transzformánsokból a 2. példa A. pontja szerint eljárva izoláljuk. 16. példa 15 A pCZ103 plazmidból származó vektorok előállítása a borjú növekedési hormon származékok kifejezésére Mivel a pCZl03 plazmid előállításakor létrehozott BstEII deléció nem befolyásolja a bGH proteint 20 kódoló szekvenciát, a találmány szerinti pCZ103 plazmidból származó plazmidok ugyanazt a bGH származékot fejezik ki, mint a pCZIOl plazmidból származtatható származékok. A találmány szerinti pCZ103 plazmid származékok előállítására azon példák szerint 25 járunk el, amelyekben a megfelelő pCZIOl plazmid származékot állítjuk elő, a III. táblázatban röviden összegezzük a pCZ103 plazmidból származó plazmidok előállítását. A III. táblázatban megadjuk a pCZ103-ból származtatható plazmidokat, a megfelelő 30 pCZIOl plazmidpár előállítását ismertető példát és az előállítás során felhasznált különböző dezoxi-ribonukleinsav fragmens nagyságát. ül. táblázat A pCZ103-ból származtatható vektorok előállítása a bGH származékok kifejezésére pCZ103-ból szár-Megfelelő A felhasznált különböző Megjegyzés maztatható vektor példa száma restrikciós fragmens pJR1.3 4. A pCZ103 plazmid 9,3 kb nagy-A felhasznált egyéb dezságú BamHI-Xbal restrikciós oxi-ribonukleinsav fragfragmensét használjuk a mensek azonosak a megapCZIOl plazmid 10,2 kb nagydott példákban használt ságú BamHI-Xbal restrikciós fragmensekkel. A pCZIOl fragmense helyett. és pCZ103 plazmidok 0,6 kb nagyságú BamHI-HgiAI restrikciós fragmensei azonosak. pAT1.3 8. A pCZ103 plazmid 9,3 kb nagyságú A felhasznált dezoxi- ribopASP1.3 9. BamHI-EcoRI restrikciós fragmensét nukleinsav fragmensek a megpASP2.3 10. használjuk a pCZIOl plazmid adott példákban felhasználpCZ154.3 12. 10,2 kb nagyságú BamHI-EcoRI resttakkal azonosak. pCZ155.3 13. rikciós fragmense helyett. pCZ156.3 14. A pCZ103 plazmidból származó plazmidokat E. coli KI2 RV308 sejtekbe transzformáljuk. A transzformánsok kifejezik az előzőekben ismertetett bGH származékokat. Mivel a pCZ103-ból származó plazmidok termoindukálható replikont tartalmaznak, amely az indukció körülményei között nem szabályozza a plazmid példányszámát, 37 °C hőmérsékleten tenyésztve maxi- 65 mális kifejeződés következik be. 26
