202281. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szelektálható és önállóan replikálódó rekobináns dezoxi-ribonukleinsav expressziós vektorok előállítására
1 HU 202281 B 2 Az itt E. coli K12 RV308/pAT2 jellel jelzett transzformánsokat TY agaron szélesztjük megfelelő antibiotikumok jelenlétében, és ezután a pAT2 plazmid termelésére és izolálásra ismert módon tenyésztjük. A transzformánsok az SDS gél-elektroforézis, RIA 5 és más vizsgálatok szerint a fenti Met-bGH származékot nagymértékben kifejezik. A pAT2 plazmid termoindukálható, úgynevezett „runaway” replikont tartalmaz, ezért 37 °C tenyésztési hőmérsékleten az adott bGH származék maximális kifejeződése követ- 10 5’ CGACC ATG GTT TIT CCG GCT ATG I I! I I I III III III III III TGG TAC CAA AAA GGC CGA TAC TTT GCC AAC GCT GTGCT III III III III I AAA CGG TTG CGA C A fenti linker szekvenciát Itakura és munkatársai 20 (1977) és Crea és munkatársai (1978) szerint állítjuk elő. A szintézis módszerét az 1. példában részletesen megadtuk. Az e helyen E. coli K12 RV308/pCZ154 jellel jelzett transzformánsokat megfelelő antibiotikumokat 25 tartalmazó TY agaron szélesztjük, és a pCZl54 plazmid termelésére és izolálására ismert módon tenyésztjük. A transzformánsok az SDS gél-elektoforézis, RIA és más vizsgálatok szerint nagymértékben fejezik ki 30 az előzőekben meghatározott Met-Val-bGH származékot. kezik be, mivel a replikon nem szabályozza a példányszámot. 12. példa A pCZ154 plazmid és az E. coli K12 RV308/pCZ154 törzs előállítása A 7. példában megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a 7. példában használt linker szekvencia helyett az alábbi dezoxi-ribonukleinsav linker szekvenciát használjuk: TCT CTG TCC GGC CTG III III III III III AGA GAC AGG CCG GAC 3’ 5’. A pVZ154 plazmid termoindukálható, úgynevezett „runaway”, a példányszám szabályozását az indukció körülményei között elvesztő replikont tartalmaz, így 37 'C tenyésztési hőmérsékleten az adott bGH származék maximálisan kifejeződik. 13. példa A pCZ155 plazmid és az E. coli K12 RV308lpCZ155 törzs előállítása A 7. példában megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a 7. példában megadott linker szekvencia helyett az alábbi dezoxi-ribonukleinsav linker szekvenciát használjuk: 5’ CGACC ATG GCT TTT CCG GCT ATG TCT CTG TCC GTC CTG I I I I I I III III III III I I I I I I III III III III TGG TAC CGA AAA GGC CGA TAC AGA GAC AGG CAG GAC TTT GCC AAC GCT GTGCT I I I I I I II I I II I AAA CGG TTG CGA C A linker szekvenciát Itakura és munkatársai (1977) és Crea és munkatársai (1978) szerint állítjuk elő. Ezt a szintézis módszert az 1. példában részletesen ismertettük. Az E. coli K12 RV308/pCZ155 transzformánsokat TY agaron szélesztjük megfelelő antibiotikumok jelenlétében, és a pCZ155 plazmid izolálására és termelésére ezután ismert módon tenyésztjük. A transzformánsok nagymértékben kifejezik az SDS gél-elekt- 50 roforézis, RIA és más vizsgálatok szerint az előzőekben ismertetett, alábbi származékot: Met-Ala-Phe- Pro-Ala-Met-Sert- Leu-Ser-Val-b’GH. 3’ 5’. A pCZ155 plazmid termoindukálható replikont tartalmaz, ez a replikon az indukció körülményei között nem szabályozza a példányszámot, így 37 °C-on tenyésztve a bGH származék maximális mértékben fejeződik ki. 14. példa A pCZ156 plazmid és az E. coli K12 RV308lpCZ156 törzs előállítása A 7. példában megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a 7. példában megadott linker szekvencia helyett az alábbi dezoxi-ribonukleinsav linker szekvenciát használjuk: 45 5’ CGATA ATG GAT TIT CCG GCT ATG TCT CTG TCC GGC CTG I III II I I I I I I III III I I I I I I III III III III 3’ TAT TAC CTA AAA GGC CGA TAC AGA GAC AGG CCG GAC TIT GCC AAC GCT GTGCT 3’ I I I I I I III III I AAA CGG TTG CGA C 5’. 25
