202281. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szelektálható és önállóan replikálódó rekobináns dezoxi-ribonukleinsav expressziós vektorok előállítására
1 HU 202281 B 2 A fentiek szerint előállított szegmenseket T4 ligázzal katalizált reakcióval egyenként kapcsoljuk egymáshoz az alábbiak szerint: a) Az 5’-nem foszforilezett 1. szegmenst 5’-foszforilezett 9 szegmens jelenlétében T4 ligázzal hozzákapcsoljuk az 5’-foszforilezett 2 szegmenssel, amikor megkapjuk az 1 duplexet [Brown és munkatársai, Methods in Enzymology, 68, 109-151 (1979)]. A duplexet preparatív gél-elektroforézissel izoláljuk 15% poliakril-amidot tartalmazó gélen. b) Az 5’-foszforilezett 3 szegmenst hozzákapcsoljuk az 5’-foszforilezett 4 szegmenshez T4 ligáz segítségével 5’- foszforilezett 11 szegmens jelenlétében, amikor megkapjuk a 2 duplexet, amit 15% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézist végezve tisztítunk. c) Az 5’-foszforilezett 5 szegmenst 5’-foszforilezett 12 és 13 szegmens jelenlétében T4 ligázzal hozzákapcsoljuk az 5’-foszforilezett 6 szegmenshez, amikor megkapjuk a 3 dezoxi- ribonukleinsav duplexet. Ezt 15% poliakril-amidot tartalmazó gél-eletroforézissel tisztítjuk. d) Az 5’-foszforilezett 7 szegmenst 5’-foszforilezett 14 és 5’- nem foszforilezett 15 szegmens jelenlétében T4 ligázzal hozzákapcsoljuk az 5’-foszforilezett 8 szegmenshez, amikor megkapjuk a 4 dezoxi-ribonukleinsav duplexet, amit 15% poliakril- amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítunk. e) A 2, 3 és 4 dezoxi-ribonukleinsav duzplexeket T4 ligáz enzimmel összekapcsoljuk, és a kapott 5 dezoxi-ribonukleinsav duplexet 15% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítjuk. f) Az 5’-foszforilezett 10 szegmenst és az 5 dezoxiribonukleinsav duplexet T4 ligázzal hozzákapcsoljuk az 1 dezoxi- ribonukleinsav duplexhez. A kapott dezoxi-ribonukleinsav duplexet (5. ábra: 110) 10% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítjuk. Ezt a dezoxi-ribonukleinsav duplexet ezután T4 polinukleotid-kináz enzimmel enzimatikusan foszforilezzük, és a foszforilezést (gamma-P32)-ATP jelenlétében végezzük. A pNM702 expressziós plazmidot úgy állítjuk elő, hogy a pKEN021 plazmid (5. ábra: 107) Xbal-BamHI fragmensét (0,1 pM; 0,4 pg) enzimatikusan kapcsoljuk 0,025 pM szintetikus dezoxi-ribonukleinsav fragmenshez (5. ábra: 110) és 0,3 pM (0,08 pg) 538 bázispárból álló fragmensünkhöz (5. ábra: 109) 24 pl reakcióelegyben 1,5 egység T4 dezoxi- ribonukleinsav ligáz jelenlétében. 16 órán át 4 'C hőmérsékleten inkubáljuk az elegyet, majd az előzőekben megadottak szerint E. coli JA221 sejteket transzformálunk. A transzformánsokat 100 pg/ml ampicillint tartalmazó agar lemezeken szelektáljuk, majd az adott expressziós plazmid forrásaként tenyésztjük. A humán növekedési hormon kifejeződését ismert radioimmun- méréssel határozzuk meg [Twomey és munkatársai, Clin. Chem., 20, 389-391 (1974)]. A mérések szerint egy sejtben legalább két millió molekula szintetizálódik. D. A pNM789 plazmid előállítása Kiindulási anyagként a pNM702 plazmidot használjuk (6. ábra: 111); ez a humán növekedési hormon expressziós plazmidja. Az előállított plazmid az alábbi aminosavszekvenciát fejezi ki: Met-Phe-Pro-Leu-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-bGH. A szarvasmarha növekedési hormon egy részét meghatározó kódoló szekvenciát hordozó két dezoxi-ribonukleinsav ffagmenst a pBR348 plazmidból (6. ábra: 112); [Miller és munkatársai, J. Bioi. Chem., 255, 7521-7524 (1980)] izoláljuk. A plazmid a pBR322 plazmid PstI restrikciós helyére klónozva tartalmaz egy 831 bázispárból álló, szarvasmarha növekedési hormont leíró szekvenciát. A Miller és munkatársai (1980) által megadott eljáráson kívül a szarvasmarha növekedési hormont leíró szekvenciát előállíthatjuk szintetikusan [Itakura és munkatársai (1977) és Crea és munkatársai (1978)], vagy előállítható ismert módon Goodman és munkatársai (1979) a szarvasmarha agyalapi mirigyéből izolált hírvivő ribonukleinsavból kiindulva. A humán és a szarvasmarha növekedési homront meghatározó kódoló szekvencia igen hasonló, és több homológiát mutat. A szarvasmarha növekedési hormont kifejező plazmid előállításakor különösen előnyösen használható a PvuII restrikciós enzimmel kapott fragmens. A keletkező ffagmensek 497 bázispár nagyságúak humán növekedési hormon és 494 bázispár hosszúak a szarvasmarha növekedési hormon esetén, a megfelelő restrikciós helyek haonló leolvasási fázisban vannak mindkét frekvencia esetén. 10 pg pNM702 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat (6. ábra: 111) 1 egység PvuII restrikciós enzimmel részlegsen emésztünk 200 pl alábbi összetételű PvuII restrikciós pufferban: 60 mmól nátrium-klorid, 6 mmól trisz-hidro-klorid, pH=7,5, 6 mmól magnézium-diklorid és 6 mmól ß-merkapto-etanol. A reakciót 37 °C hőmérsékleten végezzük 10 percen át. A reakció leállítására 10 percen át 65 "C hőmérsékleten tartjuk az elegyet, majd a dezoxi-ribonukleinsavat alkalikus foszfatázzal kezeljük, és a fragmenseket 1% agarózt tartalmazó gélen különítjük el. A 497 bázispárból álló PvuII fragmensnek megfelelő lineáris dezoxi- ribonukleinsavat (6. ábra: 113) ismert módon izoláljuk, tisztítjuk és használjuk fel a köztes plazmid (6. ábra: 114) előállítására. A lineáris fragmens valamivel gyorsabban mozdul el a gélen, mint az egyetlen helyen hasított plazmid. A pBP348 plazmid 494 bázispárból álló PvuII fragmensének előállítására 10 pg plazmidot 10 egység PvuII enzimmel emésztünk 1 órán át 37 °C hőmérsékleten 200 pl PvuII pufferral készült elegyben. A fragmenseket 6% poliakril-amidot tartalmazó gélen különítjük el, és a 494 bázispárból álló fragmenst (6. ábra: 112) ismert módon azonosítjuk és tisztítjuk. Köztes plazmidot állítunk elő (6. ábra: 114) úgy, hogy 0,2 pg pNM702 plazmidból származó PvuII fragmenst kapcsolunk 0,05 pg 494 bázispárból álló fragmensünkhöz 20 pl T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz pufferban 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz jelenlétében. A reakciót 16 órán át végezzük 4 °C hőmérsékleten. A transzformánsok előállítására transzformációt és ampicillin jeelnlétében szelekciót végzünk, majd a transzformánsokból álló PvuII fragmens jelenlétére és megfelelő orientációjára. A további 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
