202281. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szelektálható és önállóan replikálódó rekobináns dezoxi-ribonukleinsav expressziós vektorok előállítására
1 HU 202281 B 2 kísérletekhez kiválasztjuk a 494 bázispárt tartalmazó PvuII fragmenst, és a 440 bázispárból álló Xbal-Smal fragmenst tartalmazó plazmidokat. 10 pg köztes plazmidot (7. ábra: 114) 1 egység PvuII enzimmel emésztünk 200 pl PvuII pufferral készült reakcióelegyben 5 percen át 37 °C hőmérsékleten. 10 percen át 65 °C hőmérsékleten tartjuk az elegyet, majd 1% agaróz gélen eletroforézist végezve elkülönítjük és tisztítjuk az egyetlen PvuII helyet tartalmazó lineáris dezoxi-ribonukleinsavat. Ezt a 3 pg-nyi terméket 5 egység Xbal enzimmel teljesen emésztünk és alkalikus foszfatázzal kezelünk. A fragmenseket 1% agaróz gélen tisztítjuk, és a legnagyobb fragmesnt (az Xbal és az első PvuII hely között humán és szarvasmarha növekedési hormonban levő 109 bázispárt már nem tartalmazza) ismert módon izoláljuk (7. ábra: 115). A szarvasmarha növekedési hormon első 23 aminosavát (69 bázispár) leíró dezoxi-ribonukleinsav szekvencia az első PvuII restrikciós helyig két Hpall restrikciós helyet tartalmaz, az első a kódoló szekvencia első nukleotidjától 23 bázispámyi távolságra helyezkedik el. 63 bázispárból álló fragmenst (7. ábra: 116) szintetizálunk foszfo-triészter módszerrel. [Crea és munkatársai: 1978, Proc. Nate. Acad. Sei. USA 75:5765], Ez a fragmens a következő szakaszokat tartalmazza: az Ipp riboszóma kötőhelyen levő Xbal helytől számítva 19 bázispőámyi szekvencia, az ATG transzlációs startjel, majd 24 bázispámyi rész, amely meghatározza az alábbi peptidet: Phe- Pro-Leu-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, tartalmaz továbbá 20 nukleotidot, amely a szarvasmarha növekedési homront leíró szekvencia egy része (a Phe-től az első Hpall helyig). A fragmens az alábbi szekvenciájú: Xbal 5’ CTAGAGGGTATTAA TAA TGTTCCCA TTGG- II II II II I II I I I I I I I II II I I I 3 ’ TCCCA TA AT TATTA C A AGGGTA ACC-ATGA TGATGATAAGTT CCCAGCCATI I II I I II II II I I I I I I I I I I I II-TA CTACTACTA TTCAAGGGTCGGTA-GTCCTTGTC 3’ Hpall INI I I I I I-CAGGAACAGGC 5’. A 63 bázispárból álló fragmens előállítására a következő szegmenseket izoláljuk: 1. CTAGAGGGTAT 2. TAATAATGTTCC 3. CATTGGATGAT 4. GATGATAAGTTCC 5. CAGCCATGTCCTTGTC 6. ATGGGAACATTATTAATACCCT 7. TTATCATCATCATCCA 8. ATGGCTGGGAAC 9. CGGACAAGGAC. A fenti szegmenseket és T4 ligázt használva lépésenként állítjuk elő a 66 bázispárból álló fragmenst, az alábbiak szerint: a) az 5’-nem foszforilezett 1 szegmenst hozzákapcsoljuk az 5’- foszforilezett 2 szegmenshez 5’foszforilezett 6 szegmens jelenlétében T4 ligáz enzimmel, amikor megkapjuk az 1 duplexet. Ezt 15% poliakril-amidos gélen elektrofoiézissel tisztítjuk. b) Az 5’-foszforilezett 3, 4 és 5 szegmenseket 5’-foszforilezett 7, 8 és 5’-nem foszforilezett 9 szegmens jelenlétében T4 ligázzal kapcsoljuk, amikor megkapjuk a 2 dezoxi-ribonukleinsav duplexet. Ezt 15% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítjuk. c) Az 1 és 2 dezoxi-ribonukleinsav duplexeket ezután T4 ligázzal összekapcsoljuk, amikor megkapjuk a 7. ábrán 116 jellel jelzett dezoxi-ribonukleinsav duplexet, amit 15% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítunk. Ezt a dezoxi- ribonukleinsav duplexet ezután ismert módon enzimatikusan foszforilezzük T4 polinukleotid kináz enzimmel (gamma- P32)ATP jelenlétében. A 46 bázispárból álló dezoxi-ribonukleinsav fragmenst, amely reprezentálja a fentiek során leírt Hpall hely és a PvuII hely közötti szakaszt, előállíthatjuk szintetikusan, de izolálhatjuk az eredeti pBP348 plazmidból is. így, 100 |ig pBP348 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 50 egység PvuII enzimmel emésztünk 400 pl PvuII pufferban 2 órán át 37 °C hőmérsékleten. Fenolos extrakció és etanolos kicsapást követően . a kapott dezoxi-ribonukleinsavat 400 pl alábbi összetételű PstI pufferban oldjuk: 50 mmól nátrium-klorid, 6 mmól trisz-hidro-klorid, pH-7,4, 6 mmól magnézium-diklorid, 6 mmól ß-merkapto-etanol. Az elegyehez 50 egység PstI enzimet adunk, és 2 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubálunk. A dezoxi-ribonukleinsav fragmenseket 6% poliakril-amidot tartalmazó gélen futtatjuk, és a 46 bázispárból álló szekvenciát tartalmazó 135 bázispárból álló fragmenst ismert módon elkülönítjük és tisztítjuk. Az elkülönített dezoxi-ribonukleinsav 1/3 részét (megfelel 33 pg-nak) 1 egység Hpall restrikciós enzimmel részlegesen emésztjük, 100 pl alábbi összetételű Hpall pufferban: 20 mmól trisz-hidro-klorid, pH-7,4, 7 mmól magnézium-diklorid, 6 mmól ß-merkapto-etanol. A reakciót 40 percen át 37 °C hőmérsékleten végezzük. 10 percen át 65 °C hőmérsékleten tartjuk az elegyet, majd a dezoxi- ribonukleinsav fragmenseket 5% akril-amidot tartalmazó gélen futtatjuk (akril-amid-bisz arány-19:l), futtatáskor megfelelő marker fragmenseket is használunk. A 135 bázispárból álló fragmens Hpall részleges emésztésével kapott 46 bázispárból álló fragmenst (7. ábra: 112) ismert módon tisztítjuk. 0,2 pg plazmid vektor (7. ábra: 115) Xbal-PvuII fragmenst, 3,2 pikomól szintetikusan előállított, 63 bázispárból álló fragmenst (7. ábra: 116) és 0,5 pikomól 46 bázispárból álló fragmenst (7. ábra: 112) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 13
