202280. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkcionális humán urokináz fehérjék előállítására
17 HU 202280 B 18 Az aminosav-szekvencia analízissel meghatározott módon az 1-es aminosav helyzetben lévő, aminocsoportban végződő szerint az A. ébra és a 4. ábra mutatja be. A megelőző 20 aminosav az amino-végcsoportnál, metioninnal (met) kezdődve és glicinnel (gly) végződve, valószínűleg jelszekvenciaként szolgál a nagy molekulatömegű urokináz fennmaradó 411 aminosavjának kiválasztásához. Ennek a feltételezett jelszekvenciának a jellemzői - például a méret és a hidrofób tulajdonság (56, 57) - megegyeznek más jellemzett jelszekvencia jellemzőivel. A következők azok a hasítási helyek, amelyeknél a tripszin hasit, és amelyek következtében 33 kdalton kis molekulatömegű, kétláncú urokináz jön létre a nagy molekulatömegű urokinázból: lizin (lys) a 136-os helyzetben a rövid lánc aminovégcsoportű aminosavja, és a 159-es helyzetben lévő izoleucin (ile) a hosszú lánc amino-végcsoportú aminosavja (A. ábra és 4. ábra). Kis molek ulatómegű urokináz-származókok termelése Escherichia coli törzsben Hosszú trp LE összekapcsolás (5. ábra) Olyan plazmidot - pNCV (58) - építettünk fel, amely a következő tulajdonságokkal rendelkezik: 1) A plazmid a pBR322 plazmid származéka, és sejtenként körülbelül 20 példányban van jelen. 2) A plazmid rezisztenssé teszi az Escherichia coli gazdasejtjét tetraciklinnel szemben. 3) A plazmid indukálható triptofán promotort tartalmaz, amely irányítja a trp vezető peptid és a trp E szerkezeti gén összekapcsolódásával képződő fehérje (LE összekapcsolt gén) szintézisét. 4) Egyedülálló PstI restrikciós hely alakult ki a trp E génben, s ez felhasználható a PstI enzimmel készített DNS töredékek klónozásához. Ekkor a pSOM7ala4 plazmidban lévő LE gén távolabbi végén lévő EcoRI helyet két EcoRI hely melletti PstI hellyé alakítjuk át az alábbi szintetikus szekvencia alkalmazásával: AATTCTGCAG GACGTCTTAA A trp promotort és a LE gént tartalmazó DNS töredéket ezután bevittük a pBR322 plazmidba, és ilyen módon a pNCV plazmidot (47A) kaptuk. Az 5-ös helyzetű nukleotid (PstI 5’ hasítási hely) és az 1130-as helyzetű nukleotid (1. ábra) közötti PstI urokináz töredéket a pNCV plazmid PstI helyére klónoztuk oly módon, hogy összekapcsolt fehérje képződött a trp promoter indukálásakor. A nitrogénatomban végződő rész a trp LE, a szénatomban végződő rész pedig a kis molekuiatömegű urokináz. Hivatkozva az 5. ábrára, 5 Mg pUK513dT69D2 (pD2) plazmidot emésztettünk 20 egység PstI enzimmel, és a kis molekulatömegű urokinázt kódoló, 1125 bázispárból álló cDNS betét töredéket 6%-os poliakrilamid-gélen végzett elektroforézissel különítettük el. A betét mintegy 1 Mg mennyiségét nyertük ki a gélből elektroelúcióval, fenollal és kloroformmal extraháltuk, majd etanollal kicsaptuk. A pNCV vektor plazmid (58) 1 Mg mennyiségét emésztettük 10 egység PstI enzimmel, a fenollal és kloroformmal végzett extrakció után etanollal kicsaptuk. A fenti 1125 bázispórból álló töredéknek mintegy 100 ng mennyiségéhez hozzáadtuk a következő komponenseket: 100 ng mennyiségű, PstI enzimmel feltárt pNCV 20 m1 oldatban, amely tartalmaz még 20 mM trisz-hidrokloridot (pH = 7,5), 10 mM magnézium-kloridot, 10 mM DTT-t, 2,5 mM ATP-t és 30 egység T4 DNS ligázt. Az összekapcsolást egy éjszakán át végeztük 14 °C-on, majd az elegy fele mennyiségével Escherichia coli K-12 294 törzset transzformáltunk. Amikor tizenkét transzformáns dezoxiribonukleinsavját BamHI enzimmel feltártuk, azt tapasztaltuk, hogy három esetben volt meg a megfelelő irányitottság. Ezt a plazmidot (pUK33trpLEi.) (5. ábra) Escherichia coli törzsben termelve hosszú trp LE összekapcsolt fehérjét kaptunk, amely tartalmazta a 33 000 dalton molekulatömegű urokinázt. A 33 000 dalton molekulatömegű urokinázt oly módon aktiváltuk, hogy tripszinszerü aktív enzimmel hasitottuk a 3-as és 4-es helyzet, valamint a 26-os és 27-es helyzet között (lásd a 2. ábrát). Rövid trp LE összekapcsolás (6. ábra) pNCV plazmidban a BglII helyet ismert módon PstI hellyé konvertáljuk. [Maniatis, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 1982; Dr. Freifelder: Molecular Biology, Boston, 1983]. A pNCV így létesített új PstI helye és trpE gén tartományában fekvő eredeti egyetlen PstI hely közötti szakaszt Pstl-emésztés útján eltávolítjuk és a szekvenciát összekapcsoljuk. így pINCV plazmidot kapunk, amely teljesen hasonló a pNCV plazmidhoz (lásd fentebb), azzal az eltéréssel, hogy a trp E gén legnagyobb része törölve van. Ebben a plazmidban a BglII helyet PstI hellyé alakítottuk, s töröltük ezen új PstI hely és az eredeti PstI hely közötti tartományt. Körülbelül 100 ng pINCV plazmidot feltártunk PstI és Hind III enzimmel, majd fenollal és kloroformmal extraháltuk, etanollal kicsaptuk. Mintegy 3 Mg pUK33trpLEL plazmidot (6. ábra) teljesen feltártunk Hind III enzimmel és részlegesen feltártuk PstI enzimmel. Ekkor egy 1150 bázispárból álló, PstI - HindlII DNS-töredéket kaptunk, ame-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
