202280. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkcionális humán urokináz fehérjék előállítására
19 HU 202280 B 20 lyet 6%-os poliakrilamid gélen végzett elektroforézis után tovább tisztítottunk elektroelúcióval. A szerkezeti urokináz génen belüli Pst I helyet megóvtuk a feltárástól. A PstI és HindlII enzimekkel feltárt pINCV plazmid teljes mennyiségét összekevertük a pUK33trpLEL plazmid HindlII enzimmel teljesen, PstI I enzimmel részlegesen feltárt, 1150 bázispárból álló töredékével. Az összekapcsolást egy éjszakán át végeztük 14 °C-on. Az elegyet ezután Escherichia coli K-12 294 törzsbe transzformáltuk. A BaroHI enzimmel végzett feltárás megerősítette ennek a plazmidnak a szerkezetét (pUK33trp- LEs) (6. ábra). Amikor ezt a plazmidot Escherichia coli törzsben kifejeztük, olyan öszszekapcsolt fehérjét kaptunk, amelyből a 33 000 molekulatömegű urokináz aktiválható a fentebb leirt módon. A 33 kdalton molekulatőmegű urokináz közvetlen kifejezése (7. és 9. ábra) A 16-os számú nukleotiddal kezdődő urokináz DNS töredéket (1. ábra) egy pBR322 származékba klónoztuk és ekkor olyan szerkezetet kaptunk, amelyben a trp promoter közvetlenül ezen urokináz töredék előtt helyezkedik el, amely kis molekulatömegű urokinázt kódol. A pLeIFAtrpl03 plazmid (7. ábra) a pLeIFA25 plazmid (58) olyan származéka, amelyből eltávolították a LelFA géntől távoli Eco Rí helyet (59). 10 ug pLeIFAtrpl03 plazmidot (7. ábra) feltártunk 20 egység EcoRI enzimmel, fenollal és kloroformmal extraháltuk, majd etanollal kicsaptuk. A plazmid DNS molekuláinak EcoRI tapadós végeit tompa végekké nyújtottuk meg 12 egység DNS polimeráz I enzim alkalmazásával 50 pl reakcióelegyben, amely 60 mM nátrium-kloridot, 7 mM magnéziura-kloridot, 7 mM trisz-hidrokloridot (pH = 7,4) és 1 mM mennyiséget tartalmazott mindegyik ribonukleotid trifoszfátból. A reakcióelegyet 1 órán át inkubáltuk 37 °C-on, fenollal és kloroformmal exlraháltuk, és etanollal kicsaptuk. A DNS-t újra szuszpendáltuk 50 pl oldatban, amely 10 mM trisz-hidrokloridot (pH = 8) és 1 mM etilén-diamin-tetraecetsavat tartalmazott, és 500 egység bakteriális eredetű lúgos foszfatázzal kezeltük 30 percig 65 °C-on, kétszer extraháltuk, és etanollal kicsaptuk. PstI enzimmel végzett emésztés után az elegyet elektroforézisnek vetettük alá 6%-os poliakrilamid-gélen, és a körülbelül 3900 bázispárból álló vektor töredéket különítettük el elektroelúcióval. A pUK33trpLEL plazmidot Escherichia coli K-12 GM48 (dezoxiadenozin-metiláz") törzsbe transzformáltuk annak érdekében, hogy az ebből az Escherichia coli törzsből így nagyobb mennyiségben kapott, tisztított DNS jól emészthető legyen a Bell restrikciós endonukleózza) (60). Az így kapott DNS 4 pg mennyiségét 1 órán át kezeltük 50 °C-on 6 egység Bell enzimmel 75 mM magnézium-klorid, 6 mM trisz-hidroklorid (pH = 7,4), 10 mM magnézium-klorid és 1 mM DTT jelenlétében, majd 50 mM nátrium-klorid-koncentrációt állítottunk be, és emésztettük 10 egység PstI enzimmel. Elektroforézist végeztünk 6%-os poliakrilamid-gélen, és a 914 bázispárból álló töredéket vetettük alá elektroelúciónak. 14 nukleotidból álló, a met lys lys pro aminosav-szekvenciát kódoló DNS-alaprészt szintetizáltunk a foszforsav-triészteres módszerrel (47). Szekvenciája az alábbi: MetLysLysPro 5’ CTATGAAAAAGCCC 3' Ennek az alaprésznek 500 ng mennyiségét az 5’ végénél foszforileztük 10 egység T4 DNS kinázzal 20 pl reakcióelegyben, amely 0,5 mM ATP-t tartalmazott. Elkülönítettük az Escherichia coli GM48 törzsben növesztett pUK33trpLEi. plazmid 264 bázi6párból álló PstI - AccI cDNS betét töredékét. E töredéknek mintegy 500 ng mennyiségét ismét szuszpendáltuk 10 pl ionmentesitett vízben, összekevertük a foszforilezett alaprész 20 pl mennyiségével, 3 percig melegítettük 95 °C-on, majd gyorsan megfagyasztottuk etanolos szárazjeges fürdőben. A denaturált DNS-oldatban 60 mM nátrium-klorid-koncentrációt, 7 mM magnézium-klorid-koncentrációt, 7 mM trisz-hidroklorid-koncentrációt (pH = 7,4) állítottunk be, hozzáadtunk mindegyik dezoxiribonukleotid-trifoszfátból 1 mM mennyiséget, valamint 12 egység DNS polimeréz I nagy töredéket. 37 °C-on történő 2 órai inkubólás utón ezt az alaprész-párképzési reakcióelegyet fenollal és kloroformmal extraháltuk, etanollal kicsaptuk és teljesen emésztettük Bell enzimmel 50 °C-on. A reakcióelegyet 6%-os poliakrilamid gélen elektroforézisnek vetettük alá, és mintegy 50 ng mennyiségű, 200 bázispárból álló, amino-végcsoportú, tompavégű Bell töredéket különítettünk el elektroelúcióval. Ezután összekapcsoltunk mintegy 50 ng tompavégű, Bell töredéket, körülbelül 100 ng Bell - PstI karboxil-végcsoportú töredéket és mintegy 100 ng mennyiségű, 3900 körüli bázispárból álló vektor töredéket. Az összekapcsolást egy éjszakán ót végeztük 14 °C-on, majd Escherichia coli 294 törzsbe transzformáltuk. A transzformálással nyert számos termék EcoRI enzimmel végzett emésztése jelezte a megfelelő felépítést, és a DNS-szekvencia analízis alátámasztotta a kívánt szekvencia meglétét a kapott új plazmid - pUK33trpl03 (7. ábra) - beindító kodonján keresztül. Ennél a szerkezetnél a nitrogén-végcsoportú metionin után két lizin molekula következik, s a szerkezet a 2A. ábrán vázolt 5-279 közötti aminosav-szekvencióval folytatódik. Amikor ezt a plazmidot Escherichia coli törzsben termeltük, kis molekulatömegű urokináz szintézise jött létre. Ezt a fehérjét tripszinszerű aktiv enzimmel aktivál-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
