202280. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkcionális humán urokináz fehérjék előállítására
15 HU 202280 B 16 Egy második specifikus alapú cDNS készletet állítottunk elő, amely elnevezése UK89CB6 volt, s mintegy 4000 telepből állt. Az előállításához 4 ug poli A mRNS savas karbamid agarózgél 8. frakciót és 4 /ug poli A mRNS 9. frakciót használtunk fel, elegyítve (lásd a poli A mRNS méret szerinti frakcionálásával foglalkozó részt). Az oligo dTi2-is helyett 250 ng mennyiséget használtunk fel az egyes CB6 dezoxioligonukleotid keverékekből primerként (lásd a .Szintetikus DNS oligomerek előállítása urokináz szűrómintaként történő alkalmazásra' című részt). .4 teljes hosszúságú urokinázt tartalmazó telepkészlet átvizsgálása A teljes hosszúságú cDNS-t tartalmazó telepeket közvetlenül nitrocellulóz szűrökre vittük ét, és a tenyésztést 37 °C-on folytattuk. A telepeket elbontottuk, a DNS-t denaturáltuk, és a szűrőkhöz rögzítettük az .Az oligo dT alapú telepkészlet átvizsgálása urokináz szekvenciákra vonatkozólag' című részben ismertetett módon (49). 32P izotóppal jelzett DNS mintát készítettünk (54) egy olyan 143 bázispárból álló HinfI - Haell restrikciós endonukleáz töredékből, amely a pD2 cDNS betétjéből származott, és a mintát hibridizáltuk (55) a szűrőhöz rögzített, teljes hosszúságú cDNS-val. 8 x 10® CPM mintát hibridizáltunk 16 órán át, majd mostuk az (55) helyen leirt módon, és röntgenfilmmel érintkeztettük. Két tenyészetnél tapasztaltunk erős hibridizációt: az A3 és az E9 tenyészetnél. A teljes hosszúságú urokináz cDNS pA3 és pE9 plazmidjának jellemzése Az A3 plazmid DNS Pstl enzimmel végzett restrikciós analizise 360 és 50 körüli bázispárból álló cDNS betét töredéket jelzett, az E9 plazmid DNS hasonló analizise pedig mintegy 340 bázispárból álló töredéket mutatott. Amikor az egyes plazmid dezoxiribonukleinsavakat két restrikciós analízisnek vetettük alá a Pstl és az EcoRI enzimekkel, egy közös cDNS betét töredéket kaptunk, amely 190 körüli bázispárból állt. Mindegyik plazmid DNS információt kódolt az urokináz-szekvenciára vonatkozólag 5’ helyzetbe a Haell - AccI alaprész töredékhez képest. A pA3 plazmid egy további Pstl - EcoRI közötti cDNS betét töredéket is tartalmaz, amely 185 bázispárból áll, az E9 pedig egy 160 bázispárból álló további töredéket tartalmaz. A pA3 plazmid nagyobb, mintegy 360 bázispárból álló Pstl cDNS betét töredékét áz M13 mp7 vektorban (53) alklónoztuk, és meghatároztuk a szekvenciákat a didezoxinukleotidos lánclezárási módszerrel (52). A pA3 plazmid urokinázt kódoló szekvenciája hozzávetőleg a 405-ös és a 785-ös helyzet között helyezkedik el a teljes hosszúságú urokináz fehérjére vonatkozó cDNS szekvenciában, amely a 3. ábrán látható. Az UK89CB6 urokináz telepkészlet átvizsgálása Az 1900 körüli bázispárból álló UK89CB6 cDNS betétet tartalmazó telepekből származó DNS-t denaturáltuk és nitrocellulóz szűrőkhöz rögzítettük az .Az oligo dT alapú telepkészlet átvizsgálása urokináz szekvenciákra vonatkozólag' című részbe leírtak szerint. 32P izotóppal jelzett DNS mintát készítettünk (54) a pA3 plazmid cDNS betét töredékének 146 bázispárból álló, Pstl és HinfI közötti töredékéből. 40 x 10® CPM mintát hibridizáltunk 16 órán át az UK89CB6 tenyészetek szűrőhöz kötött dezoxiribonukleinsavjával, majd mostuk az (55) helyen ismertetett módon, és röntgenfilmmel érintkeztettük. Két tenyészetnél tapasztaltunk pozitív hibridizációt: UK89CB6F1 (pFl) és UK89CB6H10 (pH10). A pFl és pH 10 urokináz cDNS jellemzése A pFl plazmid Pstl enzimmel végzett restrikciós analizise 450 körüli és 125 körüli bázispárból álló cDNS betét töredékeket mutat. A pH 10 plazmiddal végzett hasonló vizsgálatnál egyetlen, mintegy 500 bázispárból álló cDNS betét töredéket kaptunk. A pFl plazmid Pstl és EcoRI enzimekkel végzett kettős restrikciós vizsgálata nem mutat EcoRI restrikciós helyet, és ugyanolyan cDNS betét töredékeket szolgáltat, mint a csak Pstl enzimmel végzett restrikció. A pHIO plazmidnál tapasztalható EcoRI restrikciós helyeknél hasítva 375 körüli és 110 körüli bázispárból álló cDNS betét töredékek képződnek. A pHIO plazmidnak ez az EcoRI helye valószinűleg ugyanaz, mint amelyik a 627-es helyzetben megfigyelhető (3. ábra). A pFl plazmid cDNS betétje nem tartalmazza ezt az EcoRI restrikciós helyet. A pH 10 plazmid cDNS betét töredékénél hosszabb cDNS betét töredékkel rendelkező pFl plazmidot választottuk ki a szekvenciák meghatározásához. A pFl plazmid cDNS betétjének mindkét Pstl restrikciós töredékét M13 mp7 vektorba alklónoztuk és a didezoxinukleotidos lánclezárási módszerrel határoztuk meg a szekvenciákat. A nagy molekulatömegű, teljes lánchosszúságú urokináz teljes aminosav-szekvenciáját kódoló, a pFl, pA3 és pD2 plazmidokból származó urokináz cDNS nukleotid szekvenciáját a 3. ábrán mutatjuk be. A pFl plazmid urokinázkódoló szekvenciáját az 1-es helyzettől körülbelül az 570-es helyzetig ábrázoltuk. A pD2 plazmid urokinázkódoló szekvenciája az 532-es és a 2304-es helyzet között található a 3. ábrán. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
