202280. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkcionális humán urokináz fehérjék előállítására
9 HU 202280 B 10 Vek torren d szerek Termelés baktériumrendszerekben A baktériumokban, például egy Escherichia coli törzsben történő felhasználásra szánt kifejező plazmidokat rendszerint úgy állíthatjuk elő, hogy pBR322-t (37) alkalmazunk vektorként, és megfelelően beillesztjük a heterológ génszekvenciát a leforditásbeinditó és -megállító jelekkel együtt a funkcionális promotorral működőképes leolvasó fázisba, felhasználva a közös vagy szitetikusan létrehozott restrikciós helyeket. A vektor egy vagy több fenotipus-kiválasztó jellemző gént és egy reprodukció-eredetet hordoz, hogy biztosított legyen a felerősítés a gazdasejten belül. A heterológ betét elrendezése olyan lehet, hogy kifejezése egy hozzákapcsolt elószekvenciával együtt történjen, amely például a trp rendszer génjeiből vezethető le. Termelés emlőstől származó sejt tenyészetében Heterológ peptid emlőstől származó sejt tenyészetében történő termelése olyan vektor kifejlesztésén alapul, amely képes idegen gén autonóm reprodukciójára és termelésére egy heterológ átíró egység irányítása mellett. Ennek a vektornak a reprodukciója szövettenyészetben úgy történik, hogy biztosítunk egy DNS-reprodukció eredetet (mint amilyen az SV40 vírustól származik) és egy segítő funkciót (T antigén) azáltal, hogy a vektort olyan sejtvonalba visszük be, amely endogén módon termeli ezt az antigént (33, 34). Az SV40 vírus késői promoters megelőzi a szerkezeti gént, és biztosítja a gén átírását. A termelés kiváltásához alkalmas vektor olyan pBR322 szekvenciából áll, amelyek kiválasztható jelzőként szolgálnak az Escherichia coli törzsben történő kiválasztáshoz (rezisztencia ampicillinnel szemben), és biztosítják a DNS-reprodukció Escherichia coli eredetét. Ezek a szekvenciák a pML-1 plazmidból vezethetők le. Az SV40 eredet egy 342 bázispárból álló PvuII - Hind III töredékből vezethető le, amely átfogja ezt a tartományt (35, 36) (mindkét vég EcoRI végekké alakítható). Ezek a szekvenciák, azon túlmenően, hogy tartalmazzák a DNS-reprodukció vírusos eredetét, kódolják a korai és késői átíró egységre vonatkozó promotort. Az SV40 eredetet átfogó tartomány irányítottsága olyan, hogy a késői átíró egység promotora az interferont kódoló gén közvetlen közelében helyezkedik el. A találmányt a mellékelt ábrák segítségével részletesen ismertetjük. Az A. ábra az urokináz polipeptidek vázlatos rajza. A kis molekulatömegű urokináz a 136. számú aminosavnál kezdődik, és a 412. számú aminosavnál fejeződik be. A nagy molekulatömegű urokináz az 1. számú aminosavnál kezdődik és a 412. számúnál fejeződik be. Ha akár a nagy, akár a kis molekulatömegű urokináz egyetlen láncból álló alakja a biológiailag aktív, két láncból álló formává alakul, ez a 158. és 159. számú aminosav közötti proteolitikus hasadás következménye. Az urokináz elóvegyülete (pre-urokináz) a 20. számú aminosavnál kezdődik. A diszulfid-kötések feltüntetett konformációs elhelyezkedése a többi szerin-proteázzal való analógián alapul. Az 1A.-1C. ábra a kis molekulatömeg (33 000 dalton), biológiailag aktív urokináz fehérjére vonatkozó pD2 plazmid cDNS betétjének nukleotid szekvenciáját és restrikciós endonukleázokkal való hasítási helyeit mutatja be. Aláhúztuk a CB6B szintetikus dezoxioligonukleotid minta nukleotid részét. A 2A. és 2B. ábrán az 1. ábra szerinti cDNS-szekvencia levezetett aminosav-szekvenciája látható. A cDNS betétrész aminosavjait 1-től 279-ig számoztuk. A 3A.-3C. ábra a teljes hosszúságú humán urokináz fehérjére vonatkozó cDNS nukleotid szekvenciáját 06 restrikciós képét szemlélteti. Hasonlóképpen aláhúztuk a CB6B mintát. A 4A. és 4B. ábrán a teljes hosszúságú urokinázra vonatkozó, levezetett aminosav-szekvencia látható a 3. ábra szerinti cDNS-szekvencia alapján. Az 5. ábra egy hosszú, összekapcsolt, 33 000 dalton körüli fehérje termeléséhez szükséges pUK33trpLEi. plazmid előállítását szemlélteti. A 6. ábra egy rövid, összekapcsolt, 33 000 dalton körüli fehérje termeléséhez szükséges pUK33trpLEs plazmid előállitását illusztrálja. A 7. ábra a 33 000 dalton méretű fehérje közvetlen termelésére szolgáló plazmid előállítását mutatja be. A 8. ábra a 33 kdalton méretű fehérje közvetlen termelésére vonatkozó plazmid egy további előállitását szemlélteti. 9. és 10. ábrán a 54 kdalton méretű urokináz és annak elővegyülete közvetlen termelésére vonatkozó plazmidok előállítása látható. A 11. ábra az 54 kdalton méretű urokináz eukariotikus sejtekben történő termelésére vonatkozó p-pEH3-Ball4 preUK54 plazmid előállítását mutatja be. A 12. ábra plazminogénnek a találmány szerint előállított urokinázzal végzett, időtől függő aktiválását mutatja. A 13. ábra a találmány szerint előállított urokináz extraktumok plazminogénaktiváló hatását szemlélteti, továbbá azt, hogy hogyan gátolják ezt az aktivitást a természetes eredetű urokinázzal szemben képződött antitestek. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
