202280. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkcionális humán urokináz fehérjék előállítására
11 HU 202280 B 12 Vrokináz mRNS előállítása Detroit 562 (emberi garatrák) sejteket (38) (ATCC-szám: CCL 138) összefolyásig tenyésztettünk Eagle-féle táptalajon (39), amelyet kiegészítettünk, hogy a kővetkezőket tartalmazza: 3% nátrium-hidrogén-karbonát (pH = 7,5), 1% L-glutamin (Irvine), 10X magzati borjüszérum, IX nátrium-piruvát (Irvine), IX nem-esszenciális aminosavak (Irvine), 2,4X HEPES (pH = 7,5), 50 /ug/ml Garamycin. A sejteket 37 °C-on inkubáltuk 5X szén-dioxidot tartalmazó atmoszférában. Az összefolyt sejteket centrifugólással különítettük el 0,25X tripszinnel 15 percig 37 °C-on végzett kezelés után. Az üzenethordozó ribonukleinsav (mRNS) elkülönítése A Detroit 562 sejtekből az összes ribonukleinsavat lényegében a Lynch és munkatársai (40) által ismertetett módon különítettük el. A sejteket centrifugálással szemcsévé alakítottuk, és mintegy 1 g mennyiségű sejtet szuszpendáltunk 10 ml oldatban, amely 10 mM nátrium-kloridot, 10 mM trisz-hidrokloridot (pH = 7,4) és 1,5 mM magnézium-kloridot tartalmazott. A sejtek elbontását úgy végeztük el, hogy NP-40 nemionos detergenst adtunk a szuszpenzióhoz IX végső koncentráció eléréséig. Centrifugálás után a ribonukleinsavat két egymást kővető extrakcióval tisztítottuk tovább 4 °C-on. Az egyik extrakciót újradesztillált fenol és kloroform elegyével, a másikat izoamilalkohollal végeztük. A vizes fázis nátriumklorid-koncentrációját 0,2 M-ra állítottuk be, és az összes RNS-t kicsaptuk kétszeres térfogat 100X-os etanol hozzáadásával és -20 °C-on történő éjszakai tárolással. A centrifugálás után a poliA mRNS-t oligo-dT cellulóz kromatográfiával (41) tisztítottuk meg az összes RNS-tól. Az 1 g sejtből általában 10-15 mg összes RNS-t kaptunk, és körülbelül 2X-a volt ennek a poliA mRNS. .4 poliA mRNS méret szerinti frakcionálása 200 ug poliA mRNS méret szerinti frakcionálását savas karbaraidgélen keresztül történő elektroforézissel értük el. A gél 1,75X agarózt, 25 mM nátriumcitrátot (pH = = 3,8) és 6 M karbamidot tartalmazott (40, 42). Az elektroforézist 7 órán át végeztük 25 mA áramerősséggel és 4 °C-on. A gélt ezután kézi úton daraboltuk fel borotvapenge segítségével. Az egyes gélszeleteket megolvasztottuk 70 °C-on, és egy olyan oldattal hígítottuk, amely 10 mM nátrium-kloridot, 10 mM trisz-hidrokloridot (pH = 7,4), 1,5 mM magnézium-kloridot és 0,1X SDS-t tartalmazott, s mennyisége 12 ml volt. Az oldatot kétszer extraháltuk vízzel, újradesztillált fenollal és egyszer kloroformmal. A frakciókat etanollal kicsaptuk, majd in vitro lefordítást végeztünk (43), hogy meghatározzuk az elért méret szerinti frakcionálást és a poliA mRNS sértetlenségét. Urokináz DNS-szekvenciákat tartalmazó, oíigo-dT-vel kiegészített telepkészlet készítése A poliA mRNS-t savas karbamidgéleken frakcionáltuk méret szerint. A 12S-nél nagyobb mRNS frakciókat összegyűjtöttük, és sablonként használtuk a cDNS kettős spirál ismert módszerekkel (44, 45) történő, oligo-dT-vel kiegészített előállításához. A cDNS-t 6X-o8 poliakrilamid gélen végzett elektroforézissel frakcionáltuk méret szerint. Elektroelúcióval 132 ng cDNS kettős spirált kaptunk, amely 350 bázispárnál hosszabb volt. A cDNS kettős spirál 30 ng mennyiségét megnyújtottuk dezoxi C maradékokkal terminális dezoxinukleotidil-transzferáz (46) enzim alkalmazásával, és összekapcsoltuk 200 ng pBR322 plazmiddal (37), amelynél előzetesen hasonló végződést alakítottunk ki a Pst I helyen (46) dezoxi G maradékokkal. Minden egyes összekapcsolt keveréket Escherichia coli K-12 294 törzsbe (ATCC 31446) transzformáltunk. Közelítőleg 10 000 transzformánst kaptunk, amely ampicillinre érzékeny, tetraciklinnel szemben rezisztens volt. Szintetikus DNS oligomerek előállítása urokináz szűrőmintaként történő alkalmazásra Nyolc szintetikus az mRNS-re komplementer, 14 bázis hosszúságú DNS oligomert készítettünk a CB6 jelű urokináz-cianogénbromid polipeptidtöredék Met-Tyr-Asn-Asp-Pro aminosav-szekvenciája alapján. Ezt a nyolc dezoxioligonukleotidot a foszforsav-triészteres módszerrel (17) szintetizáltuk a következő, két-két oligomerből álló keverékekben: (CB6A) 5’ GGGTCGTTA/GTACAT 3’, (CB6B) 5’ GGATCGTTA/GTACAT 3’, (CB6C) 5’ GGGTCATTA/GTACAT 3’, (CB6D) 5’ GGATCATTA/GTACAT 3*. Minden egyes, két oligomerból álló keveréket ezután radioaktívan foszforileztünk a következőképpen: 250 ng dezoxioligonukleotidhoz 25 pl 60 mM trisz-hidrokloridot (pH = 8), 10 mM magnézium-kloridot, 15 mM béta-merkapto-etanolt és 100 mCí ("if-32?) ATP-t (Amersham, 5000 Ci/ /millimól) adtunk. 5 egység T4 polinukleotid kinázt adtunk hozzá, majd hagytuk, hogy a reakció végbemenjen 30 perc alatt 37 °C-on. A reagáltatást 30 percig végeztük 37 °C-on, és úgy állítottuk le, hogy etilén-diamin-tetraecetsavat adtunk az elegyhez 20 mM koncentráció eléréséig. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
