202280. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkcionális humán urokináz fehérjék előállítására
3 HU 202280 B 4 A korábbi kísérletek, hogy az urokinázra vonatkozó gént klónozzák, s elérjék a termelést egy mikrobiológiai gazdasejtben, nem jártak eredménnyel (11, 11A). Lásd továbbá (6). Ratzkin és munkatársai (11), valamint Bollen és munkatársai (11A) és az ezek által ismertetett (Hung és kutatócsoportja közleményein alapuló) eredményeket összefoglaló konferenciai beszámolók (63, 64) ugyanié olyan el JArAal Javasollak urokináz klónozására és E. coli-bari történő kifejezésére, amely sem a reprodukálásra irányuló saját kísérleteink, sem az évek során szerzett tapasztalatok szerint nem bizonyult célravezetőnek. Az említett kutatók által leirt eljárás reprodukálása során sem urokinázt, sem egyéb plazminogén aktivátor hatású fehérjét nem sikerült előállítani. A kisérleti tapasztalatok szerint a kutatók által deponált és hozzáférhető klón nem alkalmas urokináznak vagy más plazminogén aktivótornak vagy valamilyen al-szekvenciájónak a kódolására; az általuk közölt klón-térkép hibás; a szerzők egy kb. 4200 bózispárból álló inszertumot írnak le az általuk urokináznak feltételezett anyagra, holott ez sokkal nagyobb, mint a tényleges urokinóz-kódoló szekvencia, amely valójában kb. 2300 bázispárt tartalmaz. Úgy gondoltuk, hogy a DNS-rekombináció és az ezzel kapcsolatos módszerek alkalmazása lehet a leghatékonyabb módja annak, hogy nagyobb mennyiségben nyerjünk jó minőségű, bioaktiv, egyéb emberi eredetű fehérjétől gyakorlatilag mentes humán urokinázt és olyan urokináz-száramazékokat, amelyek megőrzik a funkcionális biológiai aktivitásukat, és így megnyissuk az utat ezeknek az anyagoknak a különböző keringési rendellenességek vagy megbetegedések kezelésénél történő kiterjedt alkalmazása előtt. DNS-rekombinációs technológia A DNS-rekombinációs technológia jelentős fejlődési fokot ért el. A molekuláris biológusok eléggé könnyen tudják a különféle DNS-szekvenciákat rekombinálni, és ilyen módon új dezoxiribonukleinsavakat hoznak létre, amelyek a transzformált mikrobákban és sejttenyészetekben bőséges mennyiségben termelhetik az exogén fehérjét. Rendelkezésre állnak az általános módszerek a különböző .tompa végű' vagy .tapadós végű' DNS-töredékek in vitro összekapcsolásához, és ezáltal hatékony kifejező hordozók hozhatók létre, amelyekkel transzformáhatók az egyes organizmusok, s ezek ekkor irányítottan szintetizálják a kívánt exogén terméket. Az egyes termékek szintézise azonban változatlanul meglehetősen bonyolult marad, és az ismeretek még nem érték el azt a fokot, amikor előre kiértékelhető lenne az eljárás sikere. Ténylegesen, aki kísérleti alap nélkül jósol kedvező eredményeket, vállalja azt a kockázatot, hogy az eljárás a gyakorlatban kivihetetlen lesz. A lényeges elemeknek, azaz a reprodukció eredetének, egy vagy több kiválasztási jellemzőnek - amely a fenotípussal összefügg -, a kifejező hordozóknak a heterológ génbetétnek és a fennmaradó vektornak a DNS-rekombinációja általában a gazdasejten kivül történik. Az így kapott, reprodukcióra képes, rekombiuált kifejező hordozót vagy plazmidot transzformációval viszik be a sejtekbe, és a transzformált sejt tenyésztésével nagy mennyiségű rekombinált hordozóhoz jutnak. Ha a gén behelyezése megfelelően történt azokhoz a helyekhez képest, amelyek a kódolt DNS-üzenet átírását és lefordítását irányítják, akkor a létrejövő kifejező hordozó ténylegesen termeli azt a polipeptid szekvenciát, amelyet a beillesztett gén kódol. Ezt a folyamatot kifejezésnek nevezik. A terméket úgy különíthetjük el, hogy a mikrobiológiai rendszerben, ha szükséges elbontjuk a gazdasejtet, és a terméket alkalmas módon megtisztítjuk a többi fehérjétől. A gyakorlatban a DNS-rekombinációs technológia alkalmazáséval teljesen heterológ polipeptideket termelhetünk - ez az úgynevezett közvetlen kifejezés -, vagy olyan heterológ polipeptidet termelhetünk, amely egy homológ polipeptid aminosav-szekvenciájának egy részéhez kapcsolódik. Ez utóbbi esetben az előállítani kívánt, biológiailag aktiv termék néha biológiailag inaktívvá válik az összekapcsolt homológ/heterológ polipeptiden belül, s mindaddig inaktiv marad, amíg el nem hasítjuk a sejten kívüli környezetben. Lásd a (12) és (13) hivatkozást. Hasonló módon jól kidolgozottak a genetika és a sejtfiziológia tanulmányozásához szükséges sejt- vagy szövettenyészetekkel kapcsolatos ismeretek. Rendelkezésre állnak azok a módszerek, amelyekkel állandó sejtvonalakat tarthatunk fenn. E Bejtvonalak különálló, közönséges sejtek egymás utáni sorozatátvitelével készülnek. A kutatásban történő alkalmazáshoz ezeket a sejtvonalakat cseppfolyós táptalajban elhelyezett szilárd hordozón tartják, vagy tápanyagként funkcionáló hordozót tartalmazó szuszpenzióban tenyésztik. Úgy tűnik, hogy a méretnövelés inkább csak gépészeti problémát jelent. A technika idevágó állása részletesebben tanulmányozható a (14) és (15) hivatkozásban. A fehérjékkel kapcsolatos biokémiai ismeretek is elengedhetetlenek a génsebészeti eljárásokhoz. A kívánt fehérjét termelő sejtek több száz egyéb fehérjét is termelnek, amelyek a sejtanyagcsere endogén termékei. Ezek a szennyezésként jelenlevő fehérjék, más vegyületekkel együtt, toxikusak, és ha nem tisztítanánk meg tőlük a kívánt fehérjét, az azzal végzett gyógykezelésnél károkat okoznának. Ezért szükség van a fehérjék biokémiájára, amely lehetővé teszi, hogy az illető rendszernek megfelelő elválasztási mód5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
