202280. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkcionális humán urokináz fehérjék előállítására
5 HU 202280 B 6 szereket dolgozzunk ki, és homogén termékhez jussunk, amely a kívánt célra biztonságosan használható. A fehérjék biokémiája segítségével azonosíthatjuk a kívánt terméket, és meggyőződhetünk arról, hogy a - sejtek hűségesen állították azt elő, változtatások vagy mutációk nélkül. Ez a tudományág biológiai vizsgálatok, stabilitásvizsgálatok és más, a sikeres klinikai vizsgálatok és a forgalombahozatalt megelőző műveletek tervezésénél is jelentős szerepet játszik. A találmány azon a felismerésen alapul, hogy a DNS-rekombinációs technológia és a fehérje-biokémiai technológia felhasználható a humán urokináz eredményes előállítására. A találmány olyan aktív urokinázt biztosít, amely valamennyi formájában alkalmazható emberek profilaktikus vagy terápiás kezelésére a különféle keringési rendellenességek és betegségek kiküszöbölése céljából. A találmány szerint előállított humán urokináz mindegyik formája tartalmazza a biológiailag aktív csoportot; feltételezzük, hogy a természetes anyag enzimrésze két láncból álló részben található, amely a szerin proteázt tartalmazza. A találmány értelmében egy sor aktív urokináz termék állítható elő, vagy közvetlenül a biológiailag aktív alakban, vagy az in vitro kezeléshez rendelkezésre álló alakban, amikor végül is biológiailag aktív termékhez jutunk. Továbbá, a találmány eljárást biztosit teljes hosszúságú, natív, biológiailag aktív vagy biológiailag aktiválható urokináz molekulák előállítására, ahol a kapott termékek további előnye, hogy specifikus affinitással rendelkeznek a fibrin iránt. Ezt eddig egyetlen természetes eredetű urokináz terméknél nem tapasztalták. A találmány tehát olyan humán urokináz terméket biztosít, amelynek új jellemzője, hogy specifikus aktivitással rendelkezik az érzékelhető, megmaradt trombuszok iránt. Mivel az előállítást olyan sejttenyészet végzi, amely tartalmazza az illető terméket kódoló, rekombináns DNS-t, mód nyílik a humán urokináz lényegesen hatékonyabb termelésére, mint korábban lehetséges volt, és olyan alakban, amelynek a biológiailag jelentős tulajdonságai kedvezőbbek. Emellett, a gazdasejttől függően, a találmány szerinti urokináz aktivátor kisebb vagy nagyobb mértékben tartalmazhat glikozilezést, mint a nativ anyag. A találmány tárgyát tehát az ily módon előállított humán urokináz termékek, az előállításukra szolgáló eljárás, a humán urokináz enzimes részét termelhető alakban kódoló génszekvenciákat tartalmazó, reprodukcióra képes, DNS kifejező hordozók az ezekkel transzformált mikroorganizmus törzsek vagy sejttenyészetek és a humán urokináz termékek termelésének irányítására képes, a fentiek szerint transzformált törzsek vagy tenyészetek mikrobiológiai vagy sejttenyészetei képezik. A találmány azokra az eljárásokra is kiterjed, amelyekkel előállithatók a fenti urokináz génszekvenciák, DNS kifejező hordozók, mikroorganizmus törzsek és sejttenyészetek. A találmány az említett mikroorganizmusok és sejttenyészetek fermentációs eljárását is átfogja. A leírásban humán urokinázon biológiailag aktiv alakban lévő polipeptidet értünk, amelyet mikroba- vagy sejttenyészet vagy adott esetben in vitro eljárás hozott létre, és amely tartalmazza a natív anyagnak megfelelő enzimrészt. A humán urokinázt tehát a találmány szerint 1) teljes hosszúságában biztosítjuk, megkülönböztetve a természetes forrásokból eddig elkülönített anyagtól, vagy 2) más biológiailag aktiv formákban biztosítjuk, amelyek tartalmazzák a plazminogén aktiválásához elengedhetetlennek talált enzimrész helyeit, vagy 3) olyan alakban biztosítjuk, amelynél az enzimrész nitrogénatom végződéséhez metionin első aminosav vagy jel polipeptid vagy ez utóbbitól eltérő konjugált polipeptid kapcsolódik, és a metionin, a jelpeptid vagy a konjugált polipeptid specifikusan hasítható sejten belüli vagy sejten kívüli környezetben (lásd a 12 hivatkozást). Minden esetben az ily módon előállított humán urokináz polipeptideket kinyerjük és olyan mértékben tisztítjuk, hogy felhasználhatók legyenek a különféle keringési betegségek kezeléséhez. Mikroorganizmusok/Sejttenyészetek Bak tériuni törzsek/promotorok Kísérleteink során többek között az alábbi mikroorganizmusokat alkalmaztuk: Escherichia coli K-12 GM 48 törzs (thr', leu*, Br, lacYl, gal K12, gal T22, ara 14, ton A31, tsx 78, Sup E44, dam 3, dem 6), amely 1982. április 9-én lett deponálva az American Type Culture Collection mikroorganizmus-gyűjteményben ATCC 39 099 számon, és Escherichia coli K-12 294 törzs (A vég, thr, hsr*, khsm*), amely a (16) hivatkozásban szerepelt, és 1978. október 28-án lett deponálva az American Type Culture Collection mikroorganizmus-gyűjteményben ATCC 31 446 számon. Más mikróbatörzsek is hasznosaknak bizonyultak azonban, közöttük az ismert Escherichia coli törzsek, például Escherichia coli B, Escherichia coli X 1776 (ATCC 31 537, a deponálás napja 1979. július 3.) és az Escherichia coli W 3110 (F*, lambda*, protróf) (ATCC 27 325, a deponálás napja 1972. február 10.), vagy más mikróbatörzsek, amelyek közül számos deponálva van és beszerezhető az elfogadott mikroorganizmus-deponáló intézményektől, mint amilyen az American Type Culture Collection (ATCC) - v.ö. az ATCC-katalógus felsorolását. (Lásd a 17. hivatkozást). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
