202280. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkcionális humán urokináz fehérjék előállítására
A vizsgálat kivitelezése 29 HU 202280 B 30 Granelli-Piperno és Reich eljárása szerint (61) a lemezeket 1-3 órán át inkubáltuk 37 °C-on, és mértük az elbontási zónákat. Számszerű eredményeket úgy kaptunk, hogy egy standard urokináz-oldat hígításaival is elvégeztük a vizsgálatot. Az urokinázaktivitás kimutatása Termelés bakteriális úton és urokinázminta készítése Escherichia coli W3110 törzset egy olyan plazmiddal (pUK33trpLEs) transzformáltunk, amely összekapcsolt urokinár fehérjét tartalmazott. Ezt a kifejező hordozót (rövid trpLE összekapcsolás) fentebb leírtuk. A sejteket minimális mennyiségű táptalajon tenyésztettük egy éjszakán át, 1,2 értékű O.D. eléréséig 550 nm-en. Ekkor további 200 ml táptalajt adtunk hozzá. Indol-akril6avat adtunk hozzá 10 Mg/ml koncentráció eléréséig, mivel ez a vegyület valószínűleg fokozza a triptofán operon által szabályozott gének termelését. A sejteket 2 órán át inkubáltuk, majd összegyűjtöttük. A 400 ml táptalajról kapott sejteket vízben szuszpendáltuk, és guanidint adtunk hozzá 7 M koncentráció eléréséig (a végső térfogat 40 ml volt). Az oldatot 90 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten. Az oldhatatlan anyagot centrifugálással eltávolitottuk. A felülúszó folyadékot 4 órán ét dializáltuk 0,01 M trisz-hidrokloridot (pH = 7,5) és 0,1 M nátrium-kloridot tartalmazó oldattal szemben. Az oldhatatlan anyagot centrifugálással eltávolitottuk, és a mintát 2,5 órán át dializáltuk 0,01 M trisz-hidroklorid-oldattal (pH = 7,5) szemben. A mintát 3,9 x 9 cm méretű DE-52 oszlopra vittük fel, amelyet előzetesen egyensúlyba hoztunk 0,01 M trisz-hidroklorid-oldattal (pH = 7,5). Az oszlopot ugyanezzel a pufferoldattal mostuk, majd 0,01 M trisz-hidroklorid-oldattal (pH = 7,5) eluáltuk, amely 0,15 M nátrium-kloridot tartalmazott. Az aktivitással rendelkező frakciókat elegyítettük, és a további vizsgálatokhoz használtuk fel. Az aktivitás kimutatása A 12. ábra azokat az eredményeket mutatja, amelyeket plazminogén frakcionált Escherichia coli kivonatokkal végzett közvetlen aktiválásával kaptunk, a fentebb leírtakhoz hasonló körülmények között végezve a vizsgálatot. A létrejövő aktivitás függ a plazminogén jelenlététől. Ezért a mért aktivitás függ a plazminogéntől. Emellett a mért aktivitás növekszik az idővel, ami időtől függő, katalitikus plazminképződést jelez. Ezek a tulajdonságok megfelelnek az urokináz tulajdonságainak, azaz a plazminogén katalitikus aktiválásának. Amikor olyan Escherichia coli extraktumokkal végeztünk hasonló vizsgálatokat, amelyek nem tartalmazták az Escherichia coli törzsben az urokináz plazmidot, nem aktiválták a plazminogént ilyen körülmények között. Az extraktumokat a fentebb ismertetett vizsgálatoknak is alávetettük, hogy kimutassuk és számszerűen meghatározzuk az urokináz aktivitását. A 13. ábrán különböző menynyiségű, bakteriális eredetű frakció hatását mutatjuk be a plazminképződés közvetlen vizsgálatával, 10 perceB aktiválás mellett. A kapott értékeket összehasonlítjuk egy standard urokináz oldattal nyert értékekkel (viszonyított egységgel történő meghatározás). A plazminogén aktiválásnak mértéke egyenesen arányos a hozzáadott klónozott urokináz mennyiségével. Ismeretes, hogy a tisztított természetes urokinázzal szemben képződött antitestek csökkentik a természetes urokináz aktivitását. A 13. ábrán ezeknek az antitesteknek a hatását is bemutatják, amikor zérus időpontban hozzáadtuk őket a vizsgált elegyhez. Az Escherichia coli törzstől eredő anyag jelentős mértékű gátlása figyelhető meg. Ez alátámasztja, hogy az Escherichia coli törzstől eredő anyagnál megfigyelt aktivitás ugyanolyan antigén helyekkel rendelkezik, mint a természetes urokináz, és ezért mikrobiális úton valóban urokináz képződik. Hasonló eredmények figyelhetők meg az aktivitás kimutatására és az antitest gátló hatására vonatkozólag a fibrinlemezes vizsgálat alkalmazásakor. Ezeket az eredményeket az I. táblázatban foglaljuk össze. I. táblázat Az urokináz fehérje fibrinlemezes vizsgálata Minta Aktivitás, Aktivitás Gátlás viszonyított urokináz an- X egység/ml1 ti test jelenlétében, viszonyított egység/ml1 Standard urokináz 112 2.5 98 11 0.45 96 1.1 0 100 Találmány szerint előállított urokináz 480 1.12 99 224 0 100 1 A standard görbét ismert mennyiségű standard urokináz felhasználásával kaptuk. Az Escherichia coli frakciókra és az antitesttel történő gátlásra vonatkozó értékeket a 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 17
