202280. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkcionális humán urokináz fehérjék előállítására
31 HU 202280 B 32 standard görbéből extrapolálással kaptuk. A standard urokináz aktivitását 96%-ban vagy még nagyobb mértékben gátolták a hozzáadott urokináz antitestek, amelyek e fehérjével szemben képződtek. Az Escherichia 5 coli eredetű extraktumok jelentős mértékű urokinázaktivitással rendelkeztek. Amikor a természetes eredetű urokinázzal szemben létrejött antitesteket adtunk hozzá, azok majdnem teljesen gátolták ezt az aktivitást. 10 A harmadik vizsgálatfajtával (a kromogén alapanyagon alapuló vizsgálattal) szintén urokinázszerű aktivitást mutattunk ki a Escherichia coli extraktumokban. Tekintettel arra, hogy az ismertetett vizsgálatok közül 15 ez a legkevésbé érzékeny, az antitestekkel való gátlást nem végezhettük el, mivel igen nagy mennyiségű antitestre lett volna szükség ahhoz, hogy gátlást érjünk el. A fenti három vizsgálat eredményeit a 20 Calbiochem cégtől beszerzett standard urokináz felhasználásával adtuk meg kvantitatív alakban. A kapott értékek (viszonyított egységek 1 ml-re vonatkoztatva) mind azonos nagyságrendűek voltak: 500 a fibrin lemezes 25 módszernél, 100 a plazminogén aktiválásánál és 350 a kromogén alapanyagon (S2444) alapuló vizsgálatnál. A tapasztalt eltéréseket valószínűleg az okozta, hogy a vizsgálatokhoz viszonylag szennyezett anyag állt ren- 30 delkezésre. A találmány szerinti vegyületeket önmagában ismert módon gyógyászati készítményekké alakíthatjuk. Ekkor a találmány szerinti humán urokinázt gyógyászatilag alkal- 35 más vivőanyaggal/anyagokkal keverjük öszsze. Az erre a célra előnyösen alkalmazható vivőanyagokat például a következő kézikönyv ismerteti: Remington's Pharmaceutical Sciences, kiadja és szerkeszti E. W. Martin. A 40 gyógyászati készítmények hatékony mennyiségű találmány szerinti fehérjét tartalmaznak a szükséges vivőanyaggal együtt. A találmány szerint előállított humán urokinázt parenterálisan is beadhatjuk azok- 45 nak a személyeknek, akik tromboembolikus megbetegedésekben szenvednek. Az alkalmazott dózis hasonló lehet, mint más, az orvosi gyakorlatban használt kardiovaszkuláris, trombolitikus szere, például 4400 NE/testsúly 50 kg lehet az intravénás indító dózi6, majd folyamatos intravénás infúzió következhet 4400 NE/kg/óra dózissal 12 órán át olyan betegeknél, akik tüdőembóliában szenvednek. Például egy megfelelő dózisú, parenterá- 55 lisan beadható gyógyszerkészítmény gyakorlatilag homogén humán urokinázt tartalmaz, s az ampullában az urokináz aktivitása 250 000 NE, s mellette 25 mg mannit és 45 mg nátrium-klorid van jelen. A befecs- 60 kendezhető oldatot úgy készítjük el, hogy az ampulla tartalmához 5 ml steril vizet adunk, s intravénás beadáshoz alkalmas mennyiségű 0,9%-os nátrium-klorid-injekciós oldattal vagy 5X-os dextróz-injekciÓ6 oldattal ele- 65 gyitjük. A találmány szerinti humán urokináz fehérjét a meghatározott DNS génnel és az abból levezetett aminosav-szekvenciákkal definiálták. Nyilvánvaló a szakember számára, hogy természetes alléi változatok léteznek és esetenként előfordulnak. Ezeknél a változatoknál a teljes szekvencia egy vagy több aminosavban eltér, vagy egy vagy több aminosavat érintő törlések, helyettesítések, beillesztések, inverziók vagy kiegészítések fordulhatnak elő az illető szekvenciában. Emellett a DNS-rekombinációs módszer alkalmazása lehetőséget ad különböző humán urokináz-származékok előállításéra, amelyeket különféleképpen módosíthatnak az egy vagy több aminosavat érintő helyettesítések, törlések, kiegészítések vagy szubsztitúciók. A találmány minden ilyenfajta módosításra és alléi változatra kiterjed, mindaddig, amíg lényeges, jellemző humán urokináz aktivitás típusa változatlan marad. Jóllehet a találmányt egyes előnyös változatok kapcsán ismertettük, a találmány nem korlátozódik ezekre, s az oltalmi kört az igénypontok határozzák meg. A leírásban szereplő szakirodalmi hivatkozások jegyzéke 1 2 3 4 5 6 7 8 9 9A 9B 3 335 361 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás. 3 926 727 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás. 4 029 767 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás. 4 258 030 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás. 4 271 150 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás. 0 037 687 publikált európai szabadalmi bejelentés. 3 555 000 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás. Wallen P., Proc. Serono Symp., 9, 91 (1977). Thorsen S. és munkatársai, Thrombos. Diathes. Haemorrh., 28, 65 (1972). Barnett és Baron, Proc. Soc. Exptl. Bioi., 102, 308 (1959). Banlow és Lazer, Thrombosis Res., 1, 201 (1972). 10. Husain S. S. és munkatársai, Thrombosis and Hemostasis, 46, 11 (1981). 10A Wun és munkatársai, J. Bioi. Chem., 257, 3276 (1982). 11 Ratzkin és munkatársai, Proc. Natl. Acid Sei. (USA), 78, 3313 (1981). 11A Bollen A. és munkatársai, Biochem. Biophys. Rés. Commun., 103, 391 (1981). 12 2 007 676A sz. publikált brit szabadalmi bejelentés. 13 Wetzel, American Scientist, 68, 664 (1980). 18
