202280. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkcionális humán urokináz fehérjék előállítására
1 HU 202280 B 2 A találmány humán urokinázra, annak új formáira és az azt tartalmazó új készítményekre, valamint a humán urokináz funkcionális fehérjetípusai in vitro előállítására szolgáló eljárásra vonatkozik. A találmány alapját részben a nativ urokináz dezoxiribonukleinsav- (DNS) szekvenciájának és az abból levezetett aminosav-szekvenciának, valamint az urokináz molekula egyéb részeinek megismerése képezi. Ez az ismeret lehetővé teszi az urokináz különbózó formáinak előállítását DNS-rekombinációs technológia alkalmazásával, s Így megfelelő minőségű és mennyiségű termékek nyerhetők, amelyekkel elvégezhetjük a biológiai szerepük megállapításához szükséges biológiai vizsgálatokat, é6 kideríthetjük a molekula értékes részeit. Az igy szerzett ismeretek birtokában génsebészeti úton és in vitro eljárással állíthatjuk elő az urokináz előre megtervezett funkcionális típusait, és ilyen módon iparilag jelentős mennyiségben gyárthatunk olyan aktiv termékeket, amelyek korábban nem voltak hozzáférhetők. A találmány hátterének megvilágítására és egyes esetekben további részletek közlésére szolgáló publikációkat az egyszerűség kedvéért a leírásban arab számokkal jelöljük, s a leírás végén egyszerre soroljuk fel valamennyit. A találmánnyal kapcsolatos technika állását az alábbiakban ismertetjük. Humán urokináz A fibrinolitikus rendszer dinamikus egyensúlyban áll a koagulációé rendszerrel, és ezáltal sértetlen, jó állapotú érrendszert tart fenn. A koagulációs rendszer hatására fibrin rakódik le sejtközi állományként, hogy helyre álljon a hemosztatikus állapot. Ennek elérése után a fibrinolitikus rendszer eltávolítja a fibrin hálót. A fibrinolitikus folyamatot a plazmin nevű proteolitikus enzim hozza létre, amely a plazminogénböl képződik. A plazrainogén plazmafehérje-elővegyület, s aktivátor hatására bekövetkező aktiválás folytán alakul át plazminná. Az egyik ilyenfajta aktivátor az urokináz, amely egy másik aktivátorral, a sztreptokinázzal együtt jelenleg kereskedelmi forgalomban van. Mindkét készítmény heveny érrendszeri megbetegedések, például szívizominfarktus, gutaütés, tüdőembólia, mélyvisszér trombózis, perifériás ütőérelzáródás és más vénás trombózisok kezelésére javallott. összességükben ezek a betegségek rendkívül nagy veszélyforrást képeznek az emberi élet számára. A felsorolt megbetegedéseknél valamelyik érrészt részlegesen - vagy súlyos esetekben - teljesen elzárja egy vérrög: egy trombusz vagy tromboembolusz. A hagyományos alvadásgátló gyógymód, például heparin és kumarin alkalmazásával, közvetlenül nem fokozza a trombuszok vagy tromboemboluszok feloldódásét. A sztreptokinázt és az urokinázt a gyakorlatban trombolitikus szerekként használják. Mindeddig azonban súlyos problémák jelentkeztek az alkalmazásukkor. Egyik anyagnál sem tapasztalható nagyfokú affinitás a fibrin iránt, következésképpen mindkettő viszonylag megkülönböztetés nélkül aktiválja mind a vérben áramló, mind pedig a fibrinhez kötött plazminogént. Az áramló vérben képződő plazmin meglehetősen gyorsan semlegesitódik, és elvész a hatékony trombolizis számára. A visszamaradó plazmin károsítja a vérrögképződésben szerepet játszó fehérjéket, mint amilyen a fibrinogén, az V. faktor és a VIII. faktor, és ennek következtében vérzést okozhat. A fentieken túlmenően az is hátrányos, hogy a sztreptokináz erősen antigén, és a nagy antitest titerű betegeknél nem jelentkezik kellő hatás, s a kezelés nem folytatható hosszabb ideig. Az urokinázzal végzett gyógykezelés költséges - mivel az urokináz csak az emberi vizeletből vagy szővettenyészetból különíthető el -, és ezért a gyógyító gyakorlatban nem tekinthető általánosan elfogadottnak. Az urokináz számos vizsgálat tárgyát képezte mér (lásd például az 1-9. szakirodalmi helyeket). A jelenleg hozzáférhető urokinázt az emberi vizeletből vagy szővettenyészetból, például vesesejtekböl különítik el (9A, 9B). Az urokináz molekula több biológiailag aktiv alakban létezik, amely lehet nagy molekulatőmegű (mintegy 54 000 dalton) vagy kis molekulatömegü (33 000 dalton körüli). Ezek mindegyike egyetlen láncból vagy két láncból áll. A kis molekulatömegű forma enzimes hasítással jön létre a nagy molekulatömegű formából. A biológiailag aktív anyag az úgynevezett szerin proteáz részt tartalmazza, diszulfid-kötésen keresztül egy második lánchoz kapcsolva. A nagy molekulatömegű anyagnak tulajdonított mindenfajta aktivitás valószínűleg annak a következménye, hogy hasonlóan jelen van ez a két összekapcsolt lánc, a stratégiai jelentőségű diszulfid-kötés, és megszakítás található a szekvenciában - kétségkívül a molekula szerin-proteáz részében. [Lásd az A. ábrát]. Minden esetre azonban, találmányunk kidolgozásáig, nem volt ismert a 21 000 dalton körüli molekulatömegü maradék azonossága, és ennek következtében funkciója 6em, és igy nem lehetett egyértelműen eldönteni, hogy az aktivitás az urokináz melyik részének tulajdonítható. Újabban beszámoltak az urokináz peptid egy másik formájáról, amelynek aktivitása nem nagy, de specifikus (10, 10A). Úgy vélték, hogy ez az anyag a nativ urokináznak felel meg, amely a korábban elkülőnitett, fentebb ismertetett aktív formák egy elővegyülete, s valószínűleg egyetlen láncból áll. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
