202279. lajstromszámú szabadalom • Eljárás izopenicillin N-szintetáz és az azt kódoló DNS vegyületek előállítására
35 HU 202279 B 36 kezelt minta 0 E. coli K12 RV308/pCZ106 sejtki vonat-kontroli 0 Kontrollreakciók szubsztrátum nélkül 0 Bár a vizsgálat linearitása, ahogyan zónamérettel mérjük, jellegzetesen lezuhan, amikor a zónaméret 21 mm fölé megy, a vizsgálat eredményei világosan jelzik, hogy az E. coli K12 RV308/pIT337 transzformánsok izopenicillin N-szintetáz aktivitást fejeznek ki; mig ugyanezt az E. coli K12 RV308/pCZ106 transzformánsok nem teszik. Az E. coli által termelt anyag lényegében stabilabb, mint a Cephalosporium acremoniumból származó izopenicillin N-szintetáz. Ezt a nagyobb stabilitást először a fagyasztási-felengedtetési kísérletekben figyeljük meg. A C. acremonium izopenicillin N-szintetáz aktivitás gyorsan inaktiválódik újra fagyasztásra és újra felengedtetésre, de a jelen találmány szerinti, E. coli által termelt izopenicillin N-szintetáz aktivitás elég ellenálló a fagyasztásra és felengedtetésre. A nagyobb stabilitás valószínűleg a C. acremonium és E. coli enzimek közti feldolgozási különbségekből ered. így pl. a C. acremoniumból izolált izopenicillin N-szintetáz aktivitás, úgy tűnik, nem rendelkezik az első két amino-terminális aminosavgyökkel, a metioninnal és glicinnel, amelyek pedig a C. acremonium izopenicillin N-szintetáz aktivitást kódoló DNS-ben kódolnak, és amelyek jelen vannak az E. coli által termelt, jelen találmány szerinti anyagban is. Amint Tsunasawa és munkatársai kifejtették [J. of Bioi. Chem, 260 (9), 5382-91 (1985)1, az E. coli termel egy pepiidet, amely lehasitja a fehérje amino-terminális metionin-gyökét, amikor a következő gyök viszonylag kis oldallánccal rendelkezik. Az IPS fehérjékben az amino-terminális metionint glicin gyök követi, igy az amino-terminális metionin lehasad. Tekintettel az E. coli által termelt izopenicillin N-szintetáz aktivitás nagyobb stabilitására és eltérő aminosavgyök-szekvenciájára, a jelen találmány magában foglal egy új fehérjét is, az E. coli által termelt izopenicillin N-szintetázt. 4. példa A pPS20 plazmid megalkotása A. A Hindin által emésztett pIT335 plazmid előállítása 5 5 ul, 1B. példa szerint készített pIT335 plazmid DNS-t, amely - 5 *ig plazmid DNS-nek felel meg, adunk 5 pl 10 x Hindlll reakciópufferhoz (500 mmól/liter NaCl; 500 mmól/liter trisz-HCl, pH = 8,0; 100 mmól/liter MgClz; és 1 mg/ml BSA), 5 pl (- 50 egység) Hindlll restrikciós enzimhez és 35 ul HíO-hoz, és összekeverjük ezeket. Az igy létrejött reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten 4 órán át kevertetjük. A Hindlll-al emésztett pIT335 plazmid DNS-t extraháljuk egyszer fenollal majd extraháljuk egyszer CHCb-al. Az extrakciók után a llindlll-a\ emésztett plT335 plazmid DNS-t 0,25 mól/literessé tesszük NaCl-re, hígítjuk két térfogat abszolút etanollal, szárazjég-etanol fürdőben lehűtjük, majd a kicsapódott DNS-t centrifugálással összegyűjtjük. Az ezzel az eljárással nyert - 5 Mg, HindIII-al emésztett pIT335 plazmid DNS-t 10 ml TE pufferban feloldjuk és -20 °C hőmérsékleten tároljuk. A pIT221 plazmid emésztése és a pIT221 plazmid - 2,7 kb-s Hindlll restrikciós fragmenseinek izolálása, amely a higromicin rezisztencia átadó gént tartalmazza A 4 762 786 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás magában foglalja a Cephalosporium acremonium vektorjait és a transzformálásához szükséges körülményeket. A fenti amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás 1-6. folyamatábrái és 1-6. példái, amelyek ebbe a bejelentésbe referenciaként be vannak építve, magukban foglalják a plT221 plazmid megalkotását. A pIT221 plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül a 4. ábra mutatja be. A pIT221 plazmidot E. coli K12 JA221/pIT221-ből izoláljuk, lényegében a jelen bejelentés 1. példájában leírt eljárással összhangban. Mintegy 50 Mg pIT221 plazmidot emésztünk 100 ul 1 x Hindlll reakciópufferban 100 egység Hindlll restrikciós enzimmel lényegében a 4.A. példa eljáráséval összhangban. A Hindlll-al emésztett pIT221 plazmid DNS extrahálása, kicsapása és újraoldása után a 4A. példa szerinti eljárással összhangban, a DNS-t 1%-os agaróz gélre terheljük elektroforézis céljából. A pIT221 plazmid kívánt - 2,7 kb-s Hindlll restrikciós fragmensét, amely a Saccharomyces cerevisiae élesztő foszfoglicerát kinéz átíró és transzlációs aktiváló szekvenciáját tartalmazza és amely egy higromicin rezisztencia átadó foszfotranszferáz enzimet kódol, izoláljuk és tisztítjuk a gélből és más emésztési termékektől, lényegében a 2B. példa szerinti eljárással összhangban. A kívánt - 2,7 kb-s Hindlll restrikciós fragmensból mintegy 5 Mg-ot izolálunk a fenti módszerrel. A nyert tisztított fragmenst 10 m! TE pufferban oldjuk és -20 °C hőmérsékleten tároljuk. C. A pPS20 plazmid végső megalkotása Mintegy 1 m1, 4A. példa szerint készített, H/ncflIl-al emésztett pIT335 plazmid DNS-t és 4 m1, 4B. példa szerint készített, pIT221 plazmid-eredetü - 2,5 kb-s Hindlll restrikciós fragmenst ligálunk 30 m1 ligáló 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 20
