202279. lajstromszámú szabadalom • Eljárás izopenicillin N-szintetáz és az azt kódoló DNS vegyületek előállítására
37 HU 202279 B 38 pufferban 100 egység T4 DNS ligázzal lényegében a 2C. példa szerinti eljárással összhangban. A ligáit DNS alkotja a kívánt pPS20 plazmidot. A pPS20 plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül az 5. ábra mutatja be. A ~ 2,7 kb-s Hindii! restrikciós fragmenst két orientációban iktathatjuk be a pIT335 plazmidba, így a ligáit DNS alkot egy másik plazmidot is, amelyet pPS20.1-el jelölünk. A pPS20.1 funkcionálisan ekvivalens a pPS20 plazmiddal, a pPS20 plazmidtól csupán a ~ 2,7 kb-s Hindin restrikciós fragmens orientációja tekintetében különbözik. D. Az E. coli K12 JA221/pPS20 megalkotása és a pPS20 DNS izolálása E. coli K12 JA221 (NRRL B-15211) 50 ml-es tenyészetét növesztjük L-tápkőzegen, amíg az O.D.no érték eléri a ~ 0,2-t. A tenyészetet jégen 10 percen át hűtjük, és a sejteket centrifugálással összegyűjtjük. A sejtüledéket 25 ml hideg, 100 mmól/literes CaClz-ben újra szuszpendáljuk és 25 percen ót jégen hütjük. A sejteket még egyszer üledékbe visszük centrifugálással, és az üledéket 2,5 ml hideg, 100 mmól/literes CaClí-ben újra szuszpendáljuk, és jégen inkubáljuk egy éjszakán át. Ennek a sejtszuszpenziónak 200 pl-ét összekeverjük a 4C. példában készített ligáit DNS-el, és jégen inkubáljuk 20 percen át. A keveréket ezután 40 °C hőmérsékleten inkubáljuk 2 percen át, ezt követi egy 10 perces inkubálás szobahőmérsékleten. 3 ml L-tápközeget adunk a sejtkeverékhez, majd a sejteket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk két órán át, levegö-rázógépen. A sejtkeverékből alikvotokat viszünk fel L-agar lemezekre (L-tápközeg, 15 g/1 agárral), amelyek még 100 pg/ml ampicillint is tartalmaznak, és a lemezeket azután 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Az E. coli K12 JA221/pPS20 transzformánsokat az ampicillin-rezisztens transzformánsok plazmid DNS-ének restrikciós enzimes elemzésével igazoljuk. A plazmid DNS-t az E. coli K12 JA221/pPS20 és E. coli K12 JA221/pPS20.1 transzforinánsokból lényegében az 1. példában leirt folyamattal összhangban nyerjük ki, de kisebb méretekben, és a CsCl gradiens lépést elhagyjuk. 5. példa A pPS21 plazmid megalkotása A. A pIT335 plazmid DNS Ncol emésztése és Klenow-kezelése, és az így létrejött ~ 0,85 kb-s fragmens izolálása, amely a Cephalosporium acremonium átíró és transzlációs aktiváló szekvenciáját kódolja Mintegy 50 pl (50 ug-nak megfelelő), 1. példa szerint előállított pIT335 plazmid DNS-t adunk 10 ul 10 x BamHl pufferhez, 5 pl (~ 50 egység) Ncol restrikciós enzimhez és 35 pl H20-hoz, és összekeverjük ezekkel. Az így létrejött reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 4 órán ót. A reakciókeveréket ezután 0,25 mól/literessé tesszük NaCl-re, két térfogat abszolút etanollal higitjuk, 10 percig szárazjég-etanolos fürdőben hütjük, és centrifugáljuk a kicsapott DNS üledékbe vitele érdekében. Az Afcol-el emésztett plT335 plazmid DNS üledéket 50 pl Klenow-pufferban feloldjuk (40 mmól/liter kálium-foszfát puffer, pH = = 7,5; 6,6 mmól/liter MgCk; 1,0 mmól/liter 2- -merkapto-etanol; 33 pmól/liter dATP; 33 pmól/liter dCTP; 33 pmól/liter dGTP; és 33 pmól/liter TTP). 2 pl (~ 10 egység, New England Biolabs) E. coli DNS polimeráz nagy fragmenst, amelyet Klenow-fragmensként ismerünk, adunk hozzá és összekeverjük a DNS-sel, és az igy létrejött reakciókeveréket 16 °C hőmérsékleten inkubáljuk 1 órán át. A reakciót pufferolt fenollal végzett extrahálással fejezzük be. Az Ncol-e\ emésztett, Klenow-kezelt pIT335 plazmid DNS-t ezután lX-os agaróz gélre terheljük elektroforézis céljából. A ~ 0,85 kb-s restrikciós fragmenst, amely a Cephalosporium acremonium IPS gén átíró és transzlációs aktiváló szekvenciáját tartalmazza, izoláljuk a gélről és tisztítjuk, lényegében a 2B. példában leírtakkal összhangban. Mintegy 4 pg kívánt fragmenst nyerünk, ezt 10 pl TE pufferban szuszpendáljuk. B. A pPS19 köztes plazmid megalkotása 1 pg pIT221 plazmid DNS-t feloldunk 5 pl 10 x Xmal pufferban (250 mmól/liter NaCl; 60 mmól/liter trisz-HCl, pH = 7,5; 60 mmól/liter MgCk; 60 mmól/liter 2-merkapto-etanol; és 1 mg/ml BSA), 43 pl HíO-ban és 2 pl (~ 10 egység) Xmal restrikciós enzimben. Az igy .létrejött reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 4 órán át. A reakciót fenolos extrakcióval állítjuk le. Az A'mal reakciókeverék további, kloroformoB extrakciója után a reakciókeveréket NaCl-re 0,25 mól/literessé állítjuk be, felhigitjuk 2 térfogat abszolút etanollal, 10 percen ót hűtjük szárazjég-etanolos fürdőben, és a kicsapott, Amal-el emésztett pIT 221 plazmid DNS-t centrifugálással üledékbe visszük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 21
