202279. lajstromszámú szabadalom • Eljárás izopenicillin N-szintetáz és az azt kódoló DNS vegyületek előállítására
33 HU 202279 ß 34 MgSOi). A sejteket ultrahangos kezelésnek vetjük alá, hat, 5 másodperces ultrahangos lökettel, amelyet egy Sonifier Cell Disruptor, W185 Modellel végzünk (Heat Ultrasonics, Inc., Plainview, Long Island, New York), mikro-hegyet használva. Az ultrahangos löketek közti idő 60 másodperc, és a keveréket jég-etanolos fürdőben tartjuk az eljárás alatt. Az ultrahangos kezelés után a sejtkeveréket centrifugáljuk, hogy a sejttörmeléket eltávolitsuk, majd a felülúszót közvetlenül használjuk fel a meghatározásban. C. Az izopenicillin N-szintetáz aktivitás meghatározása A következőkben leírt vizsgálati eljárás Shen és munkatársainak eljárásából származik [J. of Antibiotics 37 (9), 1044-1048 (1984) J. Az izopenicillin N-szintetáz mérési reakcióját 500 jul teljes térfogatban hajtjuk végre. Hogy megindítsuk a reakciót, 1,0 ml, &-(L-oC-amino-adipil)-L-ciszteinil-D valinra 1,4 mmól/literes, és DTT-re 3,75 mmól/literes oldatot hagyjuk reagálni szobahőmérsékleten 30-60 percig, hogy redukáljunk minden dimer tripeptidet monomer formára. 50 1-t a következő tőrzsoldatok mindegyikéből alikvotokban bemérünk minden egyes vizsgálócsóbe (steril, üveg, eldobható 13 x 100 mm-es csövek): 500 mmól/liter trisz-HCl, pH = 7,4; 100 mmól/liter KC1; 2,0 mmól/liter FeSOí; és 6,7 mmól/liter aszkorbinsav. Ezután különböző mennyiségű, vízzel 150 pl-re hígított extraktumokat adunk hozzá. A tripeptid oldat mintegy 100 iA-es alikvotjait adjuk ezután minden egyes csőbe; a tripeptid hozzáadása indítja a reakciót. Mindegyik csövet Vortex-berendezésen kezeljük a szubsztrátum hozzáadása után. A reakciókeveréket tartalmazó edényeket ezután forgó-rázó fürdőbe helyezzük (250 fordulat/perc), 25 °C inkubálási hőmérsékleten. A reacióidő 45 perc. A reakció 45 perce után két 100 pl-es mintát veszünk ki mindegyik reakciókeverékből és a biológiai vizsgáló lemezekben levő üregekbe osztjuk szét, a minta maradékába pedig 100 egység penicillináz A-t adunk. A penicillinóz A-t a Riker’s Laboratories Inc.-tól szerezzük be; az enzimet 100000 egységes ampullákban árusítják, amelyet 5 ml-re rehidrálunk H20-val. 5 pl (100 egység) rehidrált penicillináz A-t adunk minden egyes reakciókeverékhez, és hagyjuk reagálni 5 percen át szobahőmérsékleten, majd 100 pl-t minden egyes penicillináz A-val kezelt extraktumból egy biológiai mérőlemez üregeibe osztunk el. Ezt a penicillináz A kezelést azért végezzük, hogy ellenőrizzük, hogy a biológiai mérőlemezeken levő sávok penicillin jelenlétének tulajdoníthatók, vagy esetleg cefalosporinnak vagy más szennyezéseknek. A penicillin N standard görbét, 0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0; és 20,0 Mg penicillin N a biológiai mérölemez üregeibe való hozzáadásával készítjük el. A penicillináz A aktivitást ellenőrizzük még az enzimkészitmény 5 /ul-ének hozzáadásával - 200pl 0,2 pg/ml-es penicillin N-hez. A biológiai mérólemezeket K31 tápagarból állítjuk össze, amelyet 30,5 g BBL Antibiotic Medium N-ll (Becton Dickinson and Company, Cockeysville, Maryland) oldásával készítünk 1 liter ionmentesitett vízben, az oldatot felforralva, majd 70 °C hőmérsékletre lehűtve, majd 35 percen át autoklávozva 121 °C hőmérsékleten és ~ 105 pascal többletnyomáson. A lemezeket Micrococcus luteus (ATCC 9341) 4 ml-es, egy éjszakán át nőtt friss tenyészetével oltjuk be, 700 ml agarra számítva. A M. luteust K544 tápközegben növesztjük, amely a következőkből áll: 5,0 g Difco pepton; 1,5 g Difco élesztökivonat; 3,5 g nátrium-klorid; 3,7 g dikálium-hidrogén-foszfát (vízmentes); 1,3 g kálium-dihidrogén-foszfát; 1,5 Difco marhahús-kivonat, 1 liter ionmentesitett vízben - az oldatot felforraljuk, 25 °C hőmérsékletre lehűtjük, pH 7,0-ra állítjuk be 1 n HCl-el vagy 1 n NaOH-val, majd 20 percen ét 121 °C hőmérsékleten autoklávozzuk - 10s pascal nyomáson felhasználás előtt. A beoltott agart 100 x 15 mm-es lemezekre osztjuk be, lemezenként 15 ml alkalmazva. Az üregeket szívást alkalmazva alakítjuk ki, eldobható 5 ml-es pipettákat használva; minden üreg 10 mm átmérőjű. Miután a lemezeket elkészítettük, és a mintákat az üregekbe elhelyeztük, a lemezeket 37 °C hőmérsékletű inkubátorba helyezzük 18 órára. A vizsgálati eredményeket úgy határozzuk meg, hogy az egyes mintaüregek körül feltisztult területek átmérőjét megmérjük, amely feltisztult területek annak eredményeképp jönnek létre, hogy a M. luteus nem képes ott nőni, ahol penicillin van jelen. A vizsgálatok eredményeit az alábbi táblázat adja meg. II. TÁBLÁZAT Az E. coli K12 RV308/pIT337-bői származó sejt-extraktumok izopenicillin N-szintetáz aktivitása. Minta Zónaméret (mm) 2 pg penicillin N standard 16 5 Mg penicillin N standard 18 10 Mg penicillin N standard 27 20 Mg penicillin N standard 31 25 pl E. coli K12 RV308/pIT337 sejtkivonat 10 50 ul E. coli K12 RV308/pIT337 sejtkivonat 22 100 ul E. coli K12 RV308/pIT337 sejtkivonat 27 150 pl E. coli K12 RV308/pIT337 sejtkivonat 29 Az összes penicillinázzal 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 19
