202279. lajstromszámú szabadalom • Eljárás izopenicillin N-szintetáz és az azt kódoló DNS vegyületek előállítására
31 HU 202279 B 32 és ~ 8,7 kb-s Ncol-Ncol restrikciós fragmenseiböl. A nyert tisztított fragnienseket egyenként feloldjuk 25 ni TE pufferban, és -20 °C hőmérsékleten tároljuk. * Hacsak másképpen nem jegyezzük meg, a restrikciós és ligáló enzimeket a New England Biolabs-tól szereztük be (32 Tozer Road, Beverly, Massachussets, MA01915. Az itt alkalmazott egység definíciója megfelel a gyártó által megadott egység definícióknak. * * 3 C. ) A plT335 plazmid Ncol és BamHI emésztése és a ~ 1,5 kb-s NcoI-BamHI restrikciós fragmens izolálása, amely az izopenicillin N-szintetázt kódolja Mintegy 25 Mg (amely 25 ul-nek felel meg) 1B. példa szerint készített plT335 plazmid DNS-t emésztünk Ncol és őamHI restrikciós enzimekkel, lényegében a 2B. példa szerinti folyamattal összhangban. A nyert NcoI-BamHI emésztett DNS-t 1%-os agaróz gélre terheljük és a kívánt - 1,5 kb-s Ncol-BamHl restrikciós fragmenst izoláljuk, lényegében a 2B. példa szerinti eljárással összhangban. Mintegy 5 /ug kívánt fragmenst nyerünk, ezt 25 pl TE pufferban izoláljuk, és -20 °C hőmérsékleten tároljuk. D. ) A pIT337 plazmid végsó megalkotása 5 pl, 2B. példa szerint tisztított, pCZ106 plazmid eredetű ~ 1,6 kb-s Ncol-BamHl és 2,5 m1 ~ 8,7 kb-s Ncol-Ncol restrikciós fragmenseket ligálunk 5 pl, a 2C. példa szerint tisztított, pIT335 plazmid eredetű, ~ 1,5 kb-s áfcoI-őamHl restrikciós fragmenshez, így képezve a plT337 plazmidot. A reakciótérfogat 30 ul, és a fentebb említett DNS fragmensekból, 1,1 pl (~ 100 egység) T4 DNS ligázból, 3 ul 10 x ligáló pufferból (0,5 mól/liter trisz-HC1, pH 7,8; 100 mmól/liter MgClz; 200 mmól/liter MgClz; 200 mmól/liter ditiotreitol (DTT); 10 mmól/liter ATP; és 1 mg/ml BSA), és 13,4 pl HzO-ból áll. A reakciókeveréket 15 °C hőmérsékleten inkubáljuk 2 órán át, ez után az idő után a reakció lényegében teljessé válik. A ligáit DNS alkotja a kivént plT337 plazmid DNS-t. A pIT337 plazmid restrikciós hely- és műveleti térképét a mellékelt ábrák közül a 3. ábra mutatja be. 3. példa Az E. coli K 12 RV308/pIT337 megalkotása és az E. coli által termelt izopenicillin N-szintetáz mérése A. Az E. coli K 12 RV308/pIT337 megalkotása E. coli K 12 RV308 (NRRL B-15624) tenyészetét 50 ml L-tápközegben növesztjük, amíg az O.Ds90 érték ~ 0,5 abszorpciós egységet eléri. A tenyészetet jégen hütjük 10 percen át, és a sejteket centrifugálással öszszegyűjtjük. A sejtüledéket újra szuszpendáljuk 25 ml hideg, 100 mmól/literes CaClz oldatban, és jégen inkubáljuk 25 percen át. A sejteket még egyszer üledékbe visszük centrifugálással, és az üledéket újra szuszpendáljuk 2,5 ml, hideg, 100 mmól/literes CaClz oldatban, és jégen inkubáljuk egy éjjelen át. 200 pl ilyen sejtszuszpenziót összekeverünk a 2D. példa szerint készitett, ligáit DNS-sel, és jégen inkubáljuk 20 percen át, majd a sejteket centrifugálással összegyűjtjük. A sejtüledéket újra szuszpendáljuk ~ 1 ml L-tápközegben, és a szuszpenziót 25 °C hőmérsékleten inkubáljuk 1 órán át. A sejtkeverék alikvotjait L-agar lemezekre (L-tápközeg 15 g/1 agarral) helyezzük, amely lemezek 50 Mg/ml kanamicint is tartalmaznak, és a lemezeket 25 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Az E. coli K 12 RV308/pIT337 transzformánsokat kanamicin-rezisztencia szelekció alapján, valamint a transzformánsok plazmid DNS-ének restrikciós enzimes elemzése alapján igazoljuk. Az E. coli K 12 RV308/plT337 Lranszformánsokból a plazmid DNS-t kinyerjük, lényegében az ‘A. példában található kitanitással összhangban, de kisebb méretekben, és a CsCl-gradiens lépés elhagyásával. B. Az E. coli K 12 RV308/pIT337 tenyésztése az izopenicillin N-szintetáz aktivitás kifejeződéséhez A 3A. példa szerint előállított E. coli K 12 RV308/pIT337 több izolátumát egyedileg inokuláljuk L-tápközeg 5 ml-es alikvotjaiba, amely tápközeg 50 Mg/ml kanamicint is tartalmaz, és a tenyészeteket levegó-rázógépen inkubáljuk 25 “C hőmérsékleten, amíg az O.D590 eléri a - 0,2 abszorpciós egységet. A tenyészeteket ezután átvisszük 37 °C hőmérsékletű levegó-rázógépre, és 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk ~ 6 órán át. A 6 órás, 37 °C hőmérsékleten végzett inkubálés után minden tenyészetből 1 ml-t kiveszünk, és a sejteket centrifugálással üledékbe visszük. A sejtüledéket egyenként mossuk 1-1 ml 10 mmól/literes NaCl oldattal, majd újra szuszpendáljuk 1,0 ml IPS extrakciós pufferral (0,05 mól/liter trisz-HCl, pH = 8,0; 0,01 mól/liter KC1, és 0,01 mól/liter 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 18
