202279. lajstromszámú szabadalom • Eljárás izopenicillin N-szintetáz és az azt kódoló DNS vegyületek előállítására
25 HU 202279 B 26 felsőbbrendűségét két megfigyelés támasztja alá: (1) a transzformációs frekvencia, amelyet a higromicin-rezisztens Cephalosporium acremonium transzformánsok számával mérünk a transzformációban alkalmazott vektor DNS mikrogramjaira számítva, 50-300-szor nagyobb, amikor az IPS aktiváló szekvenciát alkalmazzuk - a PGK aktiváló szekvenciával szemben - a higromicin rezisztencia gén kifejeződésének elősegítésére a vektoron; és (2) a regenerációs idő, amelyet azzal az idővel mérünk, amely a telepek szabad szemmel láthatóvá válásáig telik el a transzformálás után, mintegy 50%-kal kisebb, amikor az IPS aktiváló szekvenciát alkalmazzuk - a PGK aktiváló szekvenciával szemben - a higromicin rezisztencia gén kifejeződésének elösegitésére a vektoron. A Cephalosporium acremoniura átíró és transzlációs aktiváló szekvenciát lehet alkalmazni bármilyen DNS szekvencia kifejezésére C. acremoniumban, amint ezt a fentebb leirt kifejeződő vektorokkal kapcsolatban jeleztük, így a jelen találmány magában foglalja a pIT335 plazmid ~ 0,5 kb-s SaE-Ncől restrikciós fragmensén belül kódolt C. acremonium átíró és transzlációs aktiváló szekvenciának alkalmazását bármilyen DNS szekvencia kifejezésének elósegitésére, amely egy hasznos anyagot kódol. A jelen találmány szerinti vektor egy intakt, funkcionális Cephalosporium acremonium DNS szekvencia klónozásából jön létre, amely nem csupán az izopenicillin N-szintetáz aminosav-szekvenciáját kódolja, hanem az átíró és transzlációs szekvenciát is, amely szükséges az izopenicillinn N-szintetáz kifejeződésének elősegítéséhez C. acremoniumban. Hasonlóképpen a jelen találmány szerinti IPS gén magában foglalja a kódoló területtől .lefelé ' elhelyezett szekvenciákat, amelyek felelősek az átírás befejezéséért és az mRNS poliadenilező és feldolgozó jelek szolgáltatásáért. Általában az átírás befejezéséért, a poliadenilezésért és az mRNS feldolgozásért felelős szekvenciák az ~ 5000 bp-s területen belül kódoló terület stop konodjától .lefelé" kódolódnak. Ennél fogva a - 0,5 kb-s BamHI-Pstl restrikcióis fragmens, amely tartalmazza az IPS karboxi-terminális-kódoló DNS-t és az ettől .lefelé" levő szekvenciákat, tartalmazza az IPS gén átírás befejeződését valamint mRNS poliadenilezó és feldolgozó jeleit (szignáljait). Megalkotunk egy vektort, amelyet pPS27-nek nevezünk, és amely tartalmazza az IPS átíró és transzlációs aktiváló szekvenciát, amelyet a higromicin rezisztencia átadó gén követ, és amelyet az IPS gén átírás befejezödési és mRNS poliadenilezési és műveleti szignáljai követnek. Hogy a pPS27-et megalkossuk, a pIT335 plazmid ~ 1,4 kb-s BamHl-XhoI restrikciós fragmensét beiktatjuk a Saű-RamHI-gyel emésztett pUC8 plazmidba (a Sáli és Xhol átfedések összeférhetök), hogy a pIT336 plazmidot nyerjük. A pIT336 plazmidot Pstl restrikciós enzimmel kezeljük és újból kör alakúvá teszszük, hogy kiiktassuk az összes Cephalosporium DNS szekvenciát a plazmidból, kivéve a ~ 0,5 kb-s HamHI-PstI restrikciós fragmenst, amely az IPS gén átírás -befejezödési és mRNS poliadenilezési és műveleti szignáljait tartalmazza, így alkotjuk meg a pPS35 plazmidot (15. ábra). A pPS35 plazmidot azután Hindin restrikciós enzimmel emésztjük, és a pPS29 plazmid ~ 2,3 kb-s Hindlll restrikciós fragmensét, amely tartalmazza az IPS gén átíró és transzlációs aktiváló szekvenciáját, amelyet a higromicin rezisztencia átadó gén követ, beiktatjuk a HindIII-al emésztett pPS35 plazmidba, megfelelő orientációban, hogy a pPS27 plazmidot nyerjük. A pPS27 plazmid megalkotását a 11. példában írjuk le, és a pPS27 plazmid restrikciós hely- és műveleti térképét a mellékelt ábrák közül a 16. ábrában adjuk meg. A pPS27-nek hasznos származékát alkothatjuk meg a pPS27 plazmid - 2,3 kb-s Hindin és ~ 0,5 kb-s Hindin-őamHI restrikciós fragmenseinek izolálásával, és ezeknek a fragmenseknek beiktatásával helyes orientációban a pIT335 plazmid ~ 0,9 kb-s BgRll-Hindlll restrikciós fragmensébe, a pPS34 plazmidot termelve. A pPS34 plazmid tartalmazza mind a higromicin rezisztencia-átadó gént, mind az izopenicillin N-szintetázt kódoló gént, amelyeket az IPS gén szabályozó elemei szabályoznak. A pPS34 restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül a 13. ábra adja meg. A pIT336 plazmidot lehet kiindulási anyagként felhasználni egy olyan plazmid megalkotására, amely integrálódik a Cephalosporium acremonium genomban az izopenicillin N-szintetáz gén lókuszánál. Ez a plazmid, amelyet pPS37-nek jelölünk, hasznosítást nyer a beiktatási inaktiválásos tanulmányokhoz, a pPS37 plazmid transzformációjához egy Cephalosporium acremonium törzsbe, amely ennek a törzsnek az IPS-hiányos mutánsát alakítja ki, amikor a pPS37 plazmid integrálódik az IPS gén kódoló területébe. A pPS37 plazmidot úgy alkotjuk meg, hogy a pPS21A plazmid ~ 3,45 kb-s Hindlll restrikciós fragmensét, amely a higromicin rezisztencia átadó gént tartalmazza az IPS gén aktiváló szekvenciájának szabályozása alatt, beiktatjuk Nrul-el emésztett pIT336 plazmidba. A pIT336 plazmidnak van egy egyedi Nrul helye a plazmidon jelen levő IPS kódoló terület egy részletén belül. A ~ 3,45 kb-s Hindlll restrikciós fragmens - amely tompa végű lett Klenow-enzimmel végzett kezeléssel beiktatása az Nrul-el emésztett pIT336 plazmidba valójában két plazmidot alakit ki, amelyeket pPS37-nek és pPS37.1-nek nevezünk, és amelyek csupán a beiktatott fragmens orientációja szempontjából különböznek egymástól. Mind a pPS37 plazmid, mind a 15 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
