202279. lajstromszámú szabadalom • Eljárás izopenicillin N-szintetáz és az azt kódoló DNS vegyületek előállítására
27 28 HU 202279 B pPS37.1 plazmid használható a C. acremonium transzformálásárat hogy higromicin-rezisztens, IPS-hiányos transzformánsokat nyerjünk. A jelen találmány úttörő jellegű találmány annyiban, hogy ez képviseli egy olyan DNS szekvencia első klónozását és gén-manipulációját, amely azt az enzimatikus aktivitást - amelyet cikláz aktivitásnak is neveznek gyakran - kódolja, amely egy tripeptid 10 szubsztrátum kondenzálásának katolizálásához szükséges egy helyettesített á-laktámmá. Több, C. acremoniumtól eltérő organizmus fejez ki lényegében hasonló, vagy akár azonos, cikláz aktivitást. A cikláz aktivitások hason- 15 lósága különböző nemzetségek antibiotikum-termelő organizmusaiban a különböző ciklázok aminosavai és a cikláz aktivitást kódoló DNS szekvenciák megfelelő hasonlóságának eredménye. 20 A jelen találmány biztosit egy aminosav és egy DNS szekvenciát egy cikláz enzim számára, különösen a Cephalosporium acremonium izopenicillin N-szintetáz számára, és így lehet használni cikláz enzimet kódoló DNS 25 izolálására £-laktám termelő organizmusokból, így pl. a jelen DNS szekvenciákat lehet használni jelzett vizsgáló minták előállítására, amelyeket viszont lehet használni ciklózt kódoló DNS szekvenciák megkeresésére a fen- 30 tebb említett ű-laktám termelő organizmusokban. A jelen izopenicillin N-szintetáz-kódoló DNS nagy G és C tartalma, - 63%, teszi a jelen DNS vegyületeket különösen hasznossá e Streptomyces clavuligerus izopenicillin N- 35 -szintetázt kódoló DNS izolálásához. A Streptomyces DNS-röl tudjuk, hogy nagy G és C tartalmú, gyakran megközelítve a 70%-ot, úgy a jelen találmány szerinti DNS magas G és C tartalma teszi a jelen DNS vegyületet különö- 40 sen hasznossá homológ S. clavuligerus vagy más Streptomyces DNS szekvenciák izolálásához. A jelen találmány olyan DNS vegyületról szól, amelyek cikláz aktivitást kódolnak, valamint tartalmaznak olyan kifejeződő vektoro- 45 kát, amelyek ezeknek a cikláz aktivitásoknak kifejeződését elórehajtják a gazdaorganizmusok széles választékában. Az itt következő példák azt a célt szolgálják, hogy tovább illusztrálják a jelen ta- 50 lálmányt, de nem szándékunk, hogy ezekkel korlátozzuk a találmány oltalmi körét. J. példa E. coli K 12 JA221/pIT335 tenyésztése és a pIT335 plazmid izolálása A.) Az E. coli K 12 JA221/pIT335 tenyésztése 60 Az E. coli K 12 JA221/pIT335 liofilezett tenyészetét a Northern Regional Research Laboratories-töl (Peoria, Illinois) kapjuk, ahol az az NRRL B-15960 letéti számon talál- 65 ható. A liofilezett tenyészet közvetlenül használható, mint .tenyészet" az alább leirt folyamatban. 1 liter L-tápközeget (10 g tripton, 10 g 5 NaCl és 5 g élesztökivonat literenként), amely 50 /ug/mi ampicillint is tartalmaz, inokulálunk E. coli K 12 JA221/pIT335 tenyészetével, és levegőkeveréssel inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten, amíg az optikai sűrűség 590 nm-nél (OD590) ~ 1 abszorpciós egység lesz, amikor is 150 mg klóramfenikolt adunk a tenyészethez. Az inkubálást mintegy 16 órán át folytatjuk; a klóramfenikol hozzáadása meggátolja a fehérjeszintézist, és igy meggátolja a további sejtosztódást is, de lehetővé teszi, hogy a plazmid replikáció folytatódjék. B.) A pIT335 plazmid izolálása Az 1A. példában elkészített tenyészetet Sorvall GSA rotorban (DuPont Co., Instrument Product, Biomedical Division, Newtown, CN 06470) centrifugáljuk 6000 for du lat/percnél 5 percen át 4 °C hőmérsékleten. Az igy létrejött felülúszót elöntjük, és a sejtüledéket 40 ml TES pufferral mossuk (10 mmól/liter Trisz-HCl, pH 7,5; 10 mmól/liter NaCl; és 1 mmól/liter EDTA), majd újra üledékbe viszszük. Az újabb felülúszó elöntése után a sejtüledéket szárazjég-etanolos fürdőben lefagyasztjuk, majd felengedtetjük. A felengedtetett sejtüledéket újra szuszpendáljuk 10 ml, 25%-os szacharózt és 50 mmól/liter EDTA-t tartalmazó oldatban. Ezután hozzáadjuk a következőket és összekeverjük: 1 ml 5 mg/ral-es lizozim oldat; 3 ml 0,25 mól/literes EDTA oldat, pH = 8,0; és 100 pl 10 mg/ml-es RNÁ-z A; az így létrejött oldatot jégen inkubáljuk 15 percen át. 3 ml lizáló oldatot (amelyet 3 ml 10%-os Triton-X 100; 75 ml 0,25 mól/literes EDTA, pH = 8,0; 15 ml 1 mól/literes Trisz-HCl, pH 8,0; és 7 ml víz összekeverésével nyerünk) hozzáadjuk a lizozimmal kezelt sejtekhez, összekeverjük, és az igy létrejött oldatot jégen inkubáljuk további 15 percen át. A lizált sejteket szárazjég-etanol fürdőben lefagyasztjuk, majd felengedtetjük. A sejttörmeléket eltávolítjuk az oldatból, 25000 fordulat/perccel 40 percen át végzett centrifugálással SW 27 rotoron (Beckman, 7360 N. Lincoln Avenue, Lincolnwood, Illinois 60646) és puff erőit fenollal végzett extrahá- 55 lássál. 30,44 g CsCl és ~ 1 ml 5 mg/ml-es etidium-bromid oldat hozzáadása után az oldat térfogatát 40 ml-re állítjuk be és dekantáljuk egy VTÍ50 ultracentrifuga csőbe (Bcckman). A cső leforrasztása után az oldatot VTÍ50 rotorban centrifugáljuk 42000 fordulat/percnél ~ 16 órán át. Az igy létrejött plazmid-csikot, amelyet ultraibolya fénnyel teszünk láthatóvá, izoláljuk, majd Ti75 csőbe és rotorba (Beckman) helyezzük, és 50000 fordulat/percnél 16 órán át centrifugáljuk. 16
