202279. lajstromszámú szabadalom • Eljárás izopenicillin N-szintetáz és az azt kódoló DNS vegyületek előállítására
23 HU 202279 B 24 restrikciós fragmensének ligálásóval állítjuk elő a pPS23 plazmid - 860 bp-s őamlll restrikciós fraginenséhez. A pPS25 plazmidban mind a PGK, mind az IPS aktiváló szekvenciák megfelelő orientációban vannak, hogy elősegítsék a higromicin rezisztencia átadó gén kifejeződését. A pPS25 plazmid magában foglalja az IPS aktiváló szekvenciát, közvetlenül a higromicin rezisztencia átadó gén kódoló szekvenciájától .felfelé', és a PGK aktiváló szekvenciát, közvetlenül az IPS aktiváló szekvenciától .felfelé'. A pPS25 plazmid higromicin rezisztenciát ad át Cephalosporium acremoniumnak. A pPS25 plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül a 9. ábra mutatja be. A pPS22, pPS24 és pPS25 plazmidok megalkotását a 7. példa is bemutatja. A pPS25.1 plazmid csupán abban különbözik a pPS25 plazmidtól, hogy a - 0,23 kb-s Baaúil restrikciós fragmens, amely a PGK aktiváló szekvenciát tartalmazza, orientációja eltérő. A pPS25.1 plazmidban a PGK aktiváló szekvencia nem olyan orientációban helyezkedik el, amely lehetővé teszi a PGK aktiváló szekvencia számára, hogy elősegítse a higromicin rezisztencia átadó gén kifejeződését. Mind a pPS25, mind a pPS25.1 plazmid azonban transzformálja a Cephalosporium acremoniumot higromicin-rezisztens fenotípusúvá azonosan nagy frekvenciával, jelezve, hogy a PGK aktiváló szekvencia nem szükségszerű a higromicin rezisztens fenotipus kifejeződéséhez. További, jelen találmány szerinti hasznos plazmidokat, amelyek higromicin rezisztenciát adnak ét Cephalosporium acremoniumnak, meg lehet alkotni pPS21 részleges emésztésével PstI restrikciós enzimmel, majd az ezt követő újra-ligálással. A pPS28 plazmid úgy jön létre, hogy a pPS21A plazmidból kiiktatjuk a ~ 1,85 kb-s PstI restrikciós fragmenst, amely a Cephalosporium replikációs origóját tartalmazza. A pPS29 plazmid úgy jön létre, hogy a pPS21A plazmidból kiiktatjuk ugyanazt a PsÜ plazmidot, amelyet kiiktattunk, hogy a pPS28 plazmidot nyerjük, együtt a ~ 0,49 kb-s PsÜ restrikciós fragmenssel, amely a Cephalosporium replikációs origó és az IPS gén aktiváló szekvenciája között fekszik a pPS21 plazmidon. A pPS28, illetve pPS29 plazmidnak restrikciós hely- és működési térképét a 10. illetve 11. ábrákban mutatjuk be. A pPS28 és pPS29 plazmidok megalkotását a 8. példában Írjuk le. Még további hasznos származékokat alkotunk meg, pPS21A plazmidot, mint kiindulási anyagot alkalmazva. A pPS21A plazmid - 3,45 kb-s Hindii! restrikciós fragmensét beiktatjuk a pIT335 plazmid egyedi HindiiI helyére, hogy a pPS26 és pPS26.1 plazmidokat nyerjük, amelyek egymástól csupán a pPS21A plazmidból származó, beiktatott Hindlll restrikciós fragmens orientációja szempontjából különböznek. A pPS26 és pPS26.1 plazmidok 14 tartalmazzák a Cephalosporium acremoniumból származó érintetlen IPS gént és az IPS gén aktiváló szekvenciája által hajtott higromicin rezisztencia gént. A pPS26 és pPS26.1 plazmidok megalkotását a 9. példa írja le, és a pPS26 plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül a 12. ábra mutatja be. A 4 762 786 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás leír egy, a pIT221 plazmidhoz hasonló vektort, amely pIT221 vektor, amint fentebb megállapítottuk, szintén le van írva és bele van foglalva ugyanabba a bejelentésbe, de ez a hasonló vektor magában foglal még egy Cephalosporium acremonium riboszomális RNS-t kódoló DNS-t. Ennek a plazmidnak, amelyet pPS6-nak neveznek, megnóvekedett képessége van integrálódni C. acremonium kromoszomélis DNS-be az rRNS-t kódoló DNS jelenléte következtében. A pPS6 plazmid megalkotása a fentebb említett 654 919 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés 72-75. oldalán a 13. példában van belefoglalva, és ez a hivatkozott 13. példa ide referenciaként épül be. Mivel a pPS6 plazmid ugyanazt a PGK-HmR gént foglalja magában, mint a pIT221 plazmid, az a pPS6 származék, amely a PGK átíró és transzlációs aktiváló szekvenciájának helyettesítéséből jön létre a jelen találmány szerinti C. acremonium aktiváló szekvenciával, tisztán a jelen találmány oltalmi körén belül van. A pPS6 plazmid egy ~ 3,7 kb-s A'mal restrikciós fragmenst tartalmaz, amely magában foglalja a Cephalosporium acremonium rRNS génjeit. Ennek az Amal fragmensnek a jelenléte egy plazmidon növeli annak a valószínűségét, hogy a plazmid integrálódni fog a C. acremonium genomba homológ rekombinációval, amikor a plazmid transzformálódik a C. acremoniumba. így a pPS3Q és pPS30.1 plazmidokat úgy alkotjuk meg, hogy a pPS6 plazmid ~ 3,7 kb-s A'mal restrikciós fragmensét, amely a C. acremonium rRNS gének egy részét tartalmazza, beiktatjuk a pPS21A plazmid egyedi A'mal helyébe; a pPS30 és pPS30.1 plazmidok csupán az Amal restrikciós fragmens orientációja szempontjából különböznek egymástól. A pPS31 és pPS31.1 plazmidokat úgy alkotjuk meg, hogy a pPS6 plazmid - 3,7 kb-s A'mal restrikciós fragmensét beiktatjuk a pPS29 plazmid egyedi Amal helyére. A pPS30, pPS30.1, pPS31., és pPS31.1 plazmidok megalkotását a 10. példában írjuk le. A jelen találmány szerinti plazmid vektorok, amelyek hasznosítják a Cephalosporium acremonium IPS gén átíró és transzlációs aktiváló szekvenciáját, hogy elősegítsék a higromicin-rezisztencia átadó gén kifejeződését, sokkal hatásosabbak azoknál a plazmidoknál, amelyek a Saccharomyces cerevisiae PGK aktiváló szekvenciát hasznosítják a higromicin rezisztencia átadó gén kifejeződésének elősegítésére C. acremoniumban. A jelen vektorok 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
