202278. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fokozott stabilitású, rekombináns gamma-interferonok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
11 HU 202278 B 12 testekkel reagálnak - összehasonlítása azt mutatta, hogy sem a glikozilezett (molekulatömeg 29000), sem a monoglikozilezett (molekulatömeg 18000) helyzethez vándorló anyagnál nem következett be specifikus immunkicsapás az S35-ciszteinnel jelzett pDL RI-gamma Sau plazmiddal átfertözött sejtek esetén anti-gamma-interferon antitest alkalmazásakor, ellentétben az S35-metioninnal jelzett sejtekkel, amelyeknél tapasztalható volt a gamma-interferon immunkicsapása. C. Fermentálásos termelés Az emberi eredetű rekombináns gamma-interferont Escherichia coli W3110/pg»««a-CYC5 alkalmazásával termeltük 10-1000 liter közötti térfogatú sarzsokban. Fermentálás után az interferont tartalmazó Escherichia coli sejteket kinyertük a táptalajként alkalmazott húslevesből a rekombináns gamma-interferon elkülönítése és tisztítása céljából. A következőkben leírjuk a fermentálást és a sejtkinyerést. 1. Torzstenyészetek készítése és fenntartása Steril lombikokban lévő 150-500 ml steril táptalajban törzstenyészetet készítettünk. A steril táptalaj összetétele az alábbi: Bactotryptone 10 g/liter élesztőkivonat 5 g/liter nátrium-klorid 5-10 mg/liter A táptalajt ezután beoltjuk Escherichia coli W3110/pga*«a-CYC5 primer tenyészetével. A beoltott lombikot rázógépen inkubáljuk 25- -37 “C hőmérsékleten mindaddig, amig az 550 nm-nél mért abszorbancia 1,0 nem lesz. 30 térfogat %-os dimetil-szulfoxidból 50 térfogatit mennyiséget adunk a húsleveshez. A tenyészet 1-1 ml térfogatú alikvot részeit azonnal steril fiolákba töltjük és azokat lezárjuk. A fiolákat -60 °C-on vagy ennél alacsonyabb hőmérsékleten tároljuk. Mindegyik fermentáláshoz törzstenyészetet viszünk be a táptalajba oltóanyagként. 2. Oltóanyag készítése Az oltóanyagot a fentebb leirt táptalaj (L.B. Broth) alkalmazásával készítjük el rázólombikokban vagy kis fermentorokban. 37 °C hőmérsékleten 8 órán ét végzett inkubálás után az oltóanyagot fermentorba visszük át. Az oltóanyag térfogata a fermentált térfogat 2-10 százalékát alkotja. 3. Fermentálás A rekombináns gamma-interferont olyan fermentorokban termeljük, amelyek munka- 5 térfogata 10-1000 liter. A fermentáláshoz használt táptalaj az alábbi összetételű: glükóz* 10 ammónium-szulfát dikálium-hidrogén-foszfát kálium-dihidrogén-foszfát magnézium-szulfát-heptahidrát 15 nátrium-citrát-dihidrát UCON LB-625 vas(III)-klorid-hexahidrát 20 cink-szulfát-heptahidrát kobalt-klorid-hexahidrát nátrium-molibdát- 25 -dihidrát rézül l-szulfát-pentahidrát bórsav mangán-szulfát- 30 -monohidrát sósav tiamin-hidroklorid tetraciklin-hidroklorid L-triptofán* 35 élesztőkivonat 3-béta-indolil-akrilsav literenként 50-100 g 4.0- 8,0 g 3.0- 5,0 g 5.0- 8,0 g 0,5-5,1 g 0,5-2,0 g 0,2-2,0 ml 0,005-0,15 g 0,001-0,15 g 0,001-0,005 g 0,001-0,005 g 0,001-0,005 g 0,001-0,005 g 0,001-0,005 g 0,0-1,0 ml 0,0-0,1 g 0,001-0,01 g 0,1-0,5 g 2.0- 8,0 g 0,02-0,10 g * A glükóz és a triptofán egy részét már kezdetben bemérjük a fermentorba, a fenn/]o maradó részt pedig a fermentálás alatt adagoljuk. A táptalaj alkotórészeit hőkezeléssel vagy szűréssel sterilizáljuk a fermentáláshoz történő felhasználás előtt. 15 A fermentálást 25-40 °C-on vitelezzúk ki. A többi üzemi paraméter az alábbi: 50 Keverés: Levegőztetés: pH: 100-1000 fordulat/perc 0,5-1,5 tf./tf. (a levegőt oxigénnel kiegészítjük, ha szükséges) 6,5-7,5 (ammónium-hidroxid hozzáadásával állitjuk be) 4. Tisztítás a. A rekombináns gamma-interferon extrák dója 60 Az Escherichia coli sejteket olyan táptalajban szuszpendáljuk, amely sókat és alkalmas puffert tartalmaz, s pH-értéke 6-9 közötti, előnyösen 9-hez közeli. A rekombináns (15 gamma-interferont oly módon extraháljuk, hogy a sejtszuszpenziót nagynyomású kolloid H
